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文檔簡(jiǎn)介
1、番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)是一種主要針對(duì)水禽的傳染性病毒,其臨床癥狀主要表現(xiàn)在肝、脾出現(xiàn)大量灰白或黃白色壞死點(diǎn),該病毒給中國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。
由于機(jī)體先天性免疫在防御病毒入侵中起到關(guān)鍵性的作用,人們?cè)絹?lái)越關(guān)注由病毒感染誘發(fā)的免疫應(yīng)答機(jī)制。因?yàn)槊庖邞?yīng)答是機(jī)體抵抗病毒入侵的第一道防線,所以有效地激活天然免疫應(yīng)答一方面能直接清除病毒的感染,另一方面能促進(jìn)抗病毒特異性免疫應(yīng)答反
2、應(yīng)的建立。因此,研究由病毒感染誘發(fā)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。
本研究主要運(yùn)用 RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系 sh-RIG-I,sh-MDA5,sh-TLR3,sh-Visa,sh-NF-κB,sh-IRF-7和sh-IRF-3。通過(guò)PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)干擾基因?qū)DRV感染誘導(dǎo)表達(dá)IFNs的影響;采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染VG-RNA,viral RNA或cellular RNA,檢測(cè)IFNs
3、及ISG15的表達(dá)情況;使用體外干擾素刺激,觀察其對(duì)MDRV復(fù)制的影響。得到以下結(jié)果:
?。?)293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染病毒基因組RNA(VG-RNA),MDRV感染24 h后的總RNA(Viral RNA)和沒(méi)有感染MDRV的293T細(xì)胞RNA(Cellular RNA)4h,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染VG-RNA和Viral RNA的細(xì)胞,IFNs和ISG15的表達(dá)量顯著升高。
(2)MDRV感染sh-RIG-I、sh-MDA5及s
4、h-TLR3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系后,與對(duì)照組相比(sh-Luciferase細(xì)胞系),干擾素的表達(dá)量顯著下降;MDRV感染干擾Visa基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系后,與對(duì)照組相比(sh-Luciferase細(xì)胞系),干擾素的表達(dá)受到顯著抑制;MDRV感染IRF-7和IRF-3表達(dá)沉默的293T穩(wěn)定細(xì)胞系后,與對(duì)照組相比(sh-Luciferase細(xì)胞系),sh-IRF-7穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中 IFN-β的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化,IL-28A/B和IL-29表
5、達(dá)量明顯降低;在sh-IRF-3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中,干擾素表達(dá)沒(méi)有明顯變化;NF-κB抑制劑 Bay預(yù)處理細(xì)胞2 h后,接種MDRV,與對(duì)照組相比(DMSO預(yù)處理細(xì)胞2 h),干擾素的表達(dá)受到顯著的抑制。
?。?)體外合成干擾素預(yù)處理細(xì)胞不同時(shí)間(0 h、3 h、6 h、12 h)后,接種MDRV,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDRV復(fù)制量顯著下降。
?。?)MDRV感染番鴨不同時(shí)間點(diǎn)后,檢測(cè)機(jī)體上RIG-I,MDA5,TLR3和I型干擾素表
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