櫻桃谷肉鴨IRF1和IRF2基因克隆以及生物功能分析.pdf

1、干擾素（IFN）在天然的抗病毒免疫反應(yīng)中具有重要的作用，而且干擾素還參與細(xì)胞的生長、分化以及免疫調(diào)節(jié)，是一類重要的細(xì)胞因子。其中干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）對IFN以及干擾素誘導(dǎo)基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄過程具有很關(guān)鍵的作用。
　　IRFs是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)特別是針對抗病毒感染，包括誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生以及激活補(bǔ)體和自然殺傷性細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)免疫反應(yīng)，它還參與造血反應(yīng)。IRFs一共有11個成員（IRF1-IRF11)，其

2、中在哺乳動物和禽類動物檢測出了10個成員，分別是IRF1、IRF2、IRF3、IRF4/PIP/LSIRF/ICSAT、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8/ICSBP、IRF9/p48/ISGF3γ以及IRF10,IRF11目前只在魚類中檢測發(fā)現(xiàn)。這些成員在結(jié)構(gòu)上共享保守區(qū)域：一個DNA結(jié)合區(qū)域（DBD)；C末端一個IRF關(guān)聯(lián)域（IAD)(IRF1、IRF2除外）。它們在結(jié)構(gòu)上共享保守區(qū)域，但功能上不盡相同； IRF4和IRF8通過

3、免疫細(xì)胞增加端粒酶活性；IRF7是干擾素的主調(diào)節(jié)器；IRF9可以識別IRF3復(fù)合物（ISGF3）這段堿基序列，而ISGF3的識別是IFN應(yīng)對病毒刺激的一個關(guān)鍵過程；IRF10與IRF1功能有些類似，可以調(diào)節(jié)鳥苷酸結(jié)合蛋白的表達(dá)；IRF5可以結(jié)合到IFN和ISGs的啟動子等作用。IRFs在進(jìn)化分類上可以分為四個亞科：IRF1亞科（IRF1，IRF2，IRF11)、IRF3亞科（IRF3，IRF7)、IRF4亞科（IRF4，IRF8，IRF

4、9，IRF10)、IRF5亞科（IRF5，IRF6)。在功能上分為三大類：活化劑（IRF1,IRF3，IRF9)、抑制劑（IRF8)、雙功能（IRF2，IRF4，IRF5，IRF7)。
　　IRF1對于研究動物疾病是一個不錯的候選基因,也是一個具有多生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄因子，參與抗病毒反應(yīng)、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。IRF2具有連同IRF家族成員形成復(fù)雜的IRF調(diào)控系統(tǒng),并且影響抗原遞呈、細(xì)胞周期以及抑制腫瘤等作用；但是IRF1、IR

5、F2在鴨子上是否也具有相關(guān)功能目前還不清楚。
　　鴨子在畜牧行業(yè)是一種很重要的物種，每年產(chǎn)肉（主要在亞洲）300萬噸，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值；但是每年鴨子因感染病毒造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，所以我們有必要了解鴨子的某些抗病毒機(jī)制，提高鴨子的抗病毒效果。
　　本實(shí)驗(yàn)選取櫻桃谷肉鴨作為研究對象，研究內(nèi)容主要包括三部分：
　　第一部分:櫻桃谷肉鴨IRF1、IRF2的克隆鑒定與進(jìn)化分析。
　　根據(jù)NCBI上公布的鴨IRF1、IRF

6、2基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，從正常櫻桃谷肉鴨的脾臟中提取總RNA,通過普通PCR方法擴(kuò)增IRF1、IRF2的ORF序列。其中IRF1的ORF序列長954bp，編碼317個氨基酸；IRF2的ORF序列長1047bp,編碼348個氨基酸；利用軟件MEGA5.1對多個物種的IRF1、IRF2進(jìn)行進(jìn)化分析；結(jié)果顯示與櫻桃谷肉鴨同源性最高的是鴻雁（IRF1、IRF2可信度分別為93％、78%）。
　　第二部分:櫻桃谷肉鴨上IRF1、IRF2與

7、其他物種的氨基酸對比分析以及生物學(xué)功能分析。
　　利用在線軟件分析以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們對比了櫻桃谷肉鴨、雞、鼠、人的IRF1和IRF2序列，結(jié)果顯示這四個物種的氨基酸序列高度同源。參考其他文獻(xiàn)發(fā)IRF1可以分為五個區(qū)域：N端抑制域、DNA結(jié)合域、核定位域、轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域和增強(qiáng)子區(qū)域。IRF2可以也可分為四個區(qū)域：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域、干擾素關(guān)聯(lián)域和抑制域。
　　第三部分:櫻桃谷肉鴨IRF1、IRF2在健康鴨各個組織的分布情

8、況以及感染病毒（坦布蘇病毒、新型呼腸弧病毒、鴨瘟病毒）之后IRF1、IRF2的消長規(guī)律。
　　實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析結(jié)果顯示櫻桃谷肉鴨IRF1和IRF2基因在所有檢測器官中均表達(dá)，但不同組織表達(dá)量有差異，正常情況下檢測IRF1表達(dá)的組織中當(dāng)屬肺臟最高，IRF2的表達(dá)心臟、肝臟、肺臟檢測的最高。為研究櫻桃谷肉鴨IRF1和IRF2是否參與抗病毒免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)對櫻桃谷肉鴨肌肉注射鴨瘟病毒、新型呼腸弧病毒以及坦布蘇病毒

9、。然后檢測IRF1、IRF2基因在病毒感染1、3、5天后脾臟和大腦中的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，櫻桃谷肉鴨IRF1在感染病毒后1、3、5天后都迅速上調(diào)，其中鴨瘟病毒刺激后脾臟和大腦都是在1、3、5天上調(diào)倍數(shù)逐漸增加，都在第五天達(dá)到最大值（脾臟為7.33倍，大腦為7.95倍）。新型呼腸弧病毒刺激后，在1、3、5天都呈上調(diào)狀態(tài)，在第一天達(dá)到峰值（脾臟為234.5倍，大腦為20.3倍）。坦布蘇病毒刺激后，脾臟上調(diào)不是很明顯，都在10倍以下；在大

10、腦中上調(diào)非常明顯，1、3、5天都達(dá)到100倍以上，其中第一天達(dá)到最大值459.2倍。鴨瘟病毒刺激鴨子后，櫻桃谷肉鴨IRF2在大腦和脾臟的表達(dá)都是上調(diào)的，其中第一天和第三天上調(diào)倍數(shù)比較平穩(wěn)，脾臟約為35倍，大腦上調(diào)約為7倍；第五天達(dá)到最大值，脾臟上調(diào)151倍，大腦上調(diào)15倍。新型呼腸弧病毒刺激后，脾臟IRF2第一天就達(dá)到最大上調(diào)倍數(shù)234.5倍，第三天和第五天也稱上調(diào)趨勢但是上調(diào)倍數(shù)逐漸減弱。大腦在第三天達(dá)到最大上調(diào)倍數(shù)8.6倍，不過這三

11、天上調(diào)倍數(shù)較穩(wěn)定。坦布蘇病毒刺激鴨子后脾臟和大腦都是在第一天達(dá)到最大上調(diào)倍數(shù)，脾臟為52.3倍，大腦為371倍，其上調(diào)規(guī)律與新型呼腸弧病毒刺激規(guī)律相似。
　　本研究表明，櫻桃谷肉鴨中存在IRF1和IRF2這兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，且在健康鴨組織中廣泛分布。在不同類型的病毒感染櫻桃谷肉鴨后，IRF1和IRF2在大腦和脾臟中的表達(dá)量均上調(diào)，這表明這兩個因子參與宿主的抗病毒反應(yīng)。本項(xiàng)目的研究工作為進(jìn)一步探究鴨IRF1和IRF2的抗病毒作用機(jī)理