新城疫熱穩(wěn)定性天然弱毒B-,95-株融合蛋白基因的克隆及其核酸疫苗的構(gòu)建.pdf

1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文新城疫熱穩(wěn)定性天然弱毒B株融合蛋白基因的克隆及其核酸疫苗的構(gòu)建姓名：侯紹華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：裘孝良2003.5.1塑j ! 查些奎堂堡主望蘭絲苧—————————————一摘 要利J } j 從國(guó)外引進(jìn)的新城疫熟穩(wěn)定性天然弱毒1 3 9 5 株接種S P F 雞胚繁殖病毒，經(jīng)處理后提取病毒的基因紐R N A ，參考國(guó)內(nèi)外發(fā)表的N D V 融合蛋白基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物．經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合

2、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R T - P C R ) 擴(kuò)增出約1 7 0 0 b p 大小的特異性片段，將此片段回收純化后，利用T _ A 克隆技術(shù)將其克隆到P G E M - T ．- e a s y 克隆載體中，再轉(zhuǎn)化人腸桿菌J M l 0 9 感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后經(jīng)分子量比較、P C R 鑒定和酶切分析篩選m l 性克?。Y(jié)果表明，所得到的伢1 性重組子( P E G M —F ) 中含有新城瘦熱穩(wěn)定性大然弱霉B ”株F 基闊。經(jīng)核苷酸測(cè)序，該

3、基岡含一個(gè)1 6 6 2 b p 的開放閱讀框，編碼5 5 3 個(gè)氨基酸，與國(guó)外報(bào)導(dǎo)的新城疫各毒株F 基岡相比，核苻酸序列同源性為8 8 ．3 ％- ～9 6 ．4 ％．氨基酸同源性為9 2 ．1 e ／一9 6 ．4 ％。氮基酸的差異主要集中在N 端1 ．3 2殘基，該序列為F 蛋向的信號(hào)序列，在F 蛋舟新生多肽與囊膜泡結(jié)臺(tái)后不久被切F米，岡此他不是功能性F 蛋白的構(gòu)成成分，所承受的進(jìn)化強(qiáng)制就很小。將止確的重組克隆質(zhì)粒P G E M

4、—F 塒N o t l 單酶切，電泳同收純化目的片段，與同樣州N o t l 單酶切井經(jīng)去磷艘化處理的真核表達(dá)載體P e D N A 3 ．1 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌J M l 0 9 感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)P C R 鑒定和酶切分析，篩選出符合閱讀框的重組子，構(gòu)建成新城痰核酸疫苗，并用所構(gòu)建的新城疫核酸疫苗與制備的裁基因陽離子脂質(zhì)體結(jié)合進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，通過E L I S A 試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)等檢鍘核酸疫苗在雞體內(nèi)的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作