同源重組對(duì)新城疫進(jìn)化的影響及新城疫M(jìn)ukteswar疫苗株全長cDNA克隆.pdf

1、新城疫是一種在世界范圍內(nèi)流行的禽類疫病,自1926年發(fā)現(xiàn)以來,曾多次暴發(fā),給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.其病原—新城疫病毒,屬于單負(fù)鏈病毒目(Mononegavirales)副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒屬(Avulavirus),按致病性分為強(qiáng)毒株、中毒株和弱毒株.其全基因組長為15100多個(gè)核苷酸(nucleotide,nt),包含六個(gè)基因,分別編碼六個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白,其順序?yàn)?’-NP-P-M-F-HN-L-

2、5’.其中,P基因在轉(zhuǎn)錄過程中可發(fā)生RNA編輯產(chǎn)生W和V兩種非結(jié)構(gòu)蛋白.
　　新城疫病毒突變率高、復(fù)制速率快并且擁有龐大的種群數(shù)量,因此其進(jìn)化速度是非?？斓?由于RNA聚合酶無校正功能,因此,基因突變?cè)谛鲁且卟《镜倪M(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用.但近些年來,有關(guān)同源重組是否影響新城疫病毒進(jìn)化的爭議不斷,從往至今,已被大多數(shù)人所認(rèn)可的觀點(diǎn)是—新城疫病毒為負(fù)義RNA病毒,是不存在同源重組的;而近幾年來,許多研究小組通過生物信息學(xué)的方法已陸續(xù)

3、發(fā)現(xiàn)了一些負(fù)義RNA病毒中存在同源重組的證據(jù),但因?yàn)槿鄙賹?shí)驗(yàn)室證據(jù),依然備受質(zhì)疑.
　　在本研究中,通過對(duì)所有已提交的新城疫病毒的F基因的序列進(jìn)行分析時(shí),意外的發(fā)現(xiàn)了一組重組株,共包含11株,分別為D-JS-23-05、D-SD-21-05、D-SD-22-05、D-SD-24-05、D-ZJ-20-05、D-ZJ-26-05、D-ZJ-27-05、D-SD-29-05、D-SD-32-05、D-ZJ-28-05和D-ZJ-33-

4、05,這些毒株都是從中國西部活野鴨身上分離得到的.這個(gè)重組群體的發(fā)現(xiàn)是有別于之前重組個(gè)體的發(fā)現(xiàn)的,這能夠證明同源重組在新城疫病毒的進(jìn)化過程中穩(wěn)定存在并遺傳,并為新城疫病毒中存在同源重組的論斷提供了更為有利的證據(jù).當(dāng)然,有利的實(shí)驗(yàn)證據(jù)會(huì)更具說服力,因此,本實(shí)驗(yàn)室正在努力構(gòu)建新城疫病毒同源重組實(shí)驗(yàn)系統(tǒng).
　　構(gòu)建新城疫病毒同源重組實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的基礎(chǔ)就是要構(gòu)建新城疫病毒的反向遺傳系統(tǒng),主要包括四部分內(nèi)容:構(gòu)建全長cDNA克隆、構(gòu)建表達(dá)NP、

5、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的BHK-21細(xì)胞系及將全長cDNA克隆和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的BHK-21細(xì)胞系中拯救出活病毒.由于工作量較大,本論文中只是完成了其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)—構(gòu)建新城疫病毒的全長cDNA克隆,實(shí)驗(yàn)材料為新城疫病毒Mukteswar疫苗株,通過分段克隆的方法,最終將Mukteswar的全長cDNA連于低拷貝質(zhì)?！猵MC18上(全長cDNA的起始位置添加了T7啟動(dòng)子序列,末尾添加了丁肝核酶