30789.花背蟾蜍晶狀體發(fā)育相關(guān)pax6variant新基因生物學(xué)特性及功能的初步研究

1、：：蘭煎!查窒亟堂焦迨塞原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。學(xué)位論文中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均己明確注明出處。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的科研成果。對(duì)本文的研究成果做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名：凌壟：日期：中文摘要Pax6是眼發(fā)育過(guò)程中最重要的調(diào)控基因之一

2、。從果蠅到人類等大量物種的眼發(fā)育和晶狀體決定過(guò)程中都存在Pax6。Pax6可以形成多種蛋白亞型，如Pax6、Pax6APD和Pax6(Sa)等。已有研究表明Pax6調(diào)控作用的多樣性是由Pax6蛋白不同亞型控制的。本課題通過(guò)建立花背蟾蜍晶狀體不同發(fā)育時(shí)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以鰓血循環(huán)期的胚胎為材料，采用RACE(RapidAmpliphicationofcDNAEnds)的方法，成功克隆得到花背蟾蜍Pax6variant新基因(Genebank：

3、FJl75151)。將該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括載體片段去除、基因開(kāi)放可讀框COpenReadingFrame，ORF)預(yù)測(cè)、基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、同源性的分析等。與花背蟾蜍Pax6進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者的差異在PST域3’端，相似性為531％。PST域結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致反式激活功能的改變。配對(duì)盒基元序列和同源異型域這兩個(gè)主要功能區(qū)高度保守性意味著該基因在基礎(chǔ)發(fā)育過(guò)程中的重要作用。通過(guò)RTPCR方法獲得花背蟾蜍Pax6和Pax6var

4、iant差異部分基因序列，將其克隆到pMD18T載體上，測(cè)序正確后將其克隆至pGEX4T3融合表達(dá)載體上構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEXPax6和pGEXPax6variant。經(jīng)測(cè)序后正確的重組子轉(zhuǎn)化入Rosetta(DE3)表達(dá)宿主菌中，誘導(dǎo)表達(dá)GSTPax6和GSTPax6variant融合蛋白。經(jīng)GST親和柱層析進(jìn)一步純化獲得了可溶性重組蛋白。以純化的融合蛋白GSTPax6和GSTPax6variant分別作為抗原，免疫家兔制備多克隆抗體

5、。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EuSA)、WesternBlot檢測(cè)其抗血清的效價(jià)、靈敏度和特異性。結(jié)果表明，Pax6和Pax6variant血清效價(jià)均達(dá)到1：100000以上。應(yīng)用WesternBlot初步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子Pax6從鰓血循環(huán)期到鰓蓋完全封閉期都有表達(dá)，而Pax6variant僅在鰓血循環(huán)期表達(dá)，表明Pax6在花背蟾蜍晶狀體發(fā)育過(guò)程中起了更為重要的作用。Pax6variant蛋白是一種Pax6截短蛋白，PST域3’端的因短缺而失