29949.擬南芥nadph氧化酶(d和f型)與磷脂酸相互作用及其在aba信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)系研究

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文擬南芥NADPH氧化酶（D和F型）與磷脂酸相互作用及其在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)系研究姓名：朱會(huì)英申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：章文華200910擬南芥NADPH氧化酶(D和F型)與磷脂酸相互作用及其在ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)系研究l，2位脂肪酸為油酸(dil8：1)PA、亞油酸(dil8：2)PA、棕櫚酸和油酸(16：O18：1)PA、棕櫚酸和亞油酸(16：018：2)PA、硬脂酸和亞油酸(18：018：2)

2、PA及天然PA(來(lái)自蛋黃)均與蛋白結(jié)合。用酶聯(lián)免疫法(ELIsA)進(jìn)一步證明16：o18：2PA與蛋白特異結(jié)合。為了進(jìn)一步確定PA和A仃bollD(F)結(jié)合區(qū)域，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列A仃bolD和AtrbohF的截?cái)嗥危鹘財(cái)嗥卧谠酥斜磉_(dá)、純化、并進(jìn)行westem檢測(cè)。通過脂肪westem印跡(fatⅥ陀stemblot)和脂微囊結(jié)合方法(1iposonlebindingassay)，我們確定了PA一船bohD結(jié)合的片段區(qū)域在N端的l

3、oo330氨基酸之間，PAA曲otlF結(jié)合的片段區(qū)域在N端的104—341氨基酸之間。進(jìn)一步的截?cái)嗥伪砻鱌A№lD結(jié)合區(qū)域在140到160位氨基酸片段。通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，證明AtrbollD的(149，150，156，157)精氨酸是PAA1而011D結(jié)合的主要位點(diǎn)我們構(gòu)建了C端融合HA(Hemaggluti血)標(biāo)簽的A曲oml60(1160缸)、A劬ohDR(149，150，156，157)A、A仃bollFl71(1171aa)、A

4、仃bollFAL(156，157)RR，并在保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了這4個(gè)蛋白片段，并用熒光標(biāo)記的PA進(jìn)行免疫共沉淀，證實(shí)R(149，150，156，157)對(duì)AtrbohDl60(1160枷的PA結(jié)合是重要的。為了驗(yàn)證PAAnbohS結(jié)合對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞氣孔調(diào)節(jié)的生理功能，我們以擬南芥礎(chǔ)婦J、加6D加I和咖6D脅等突變體為實(shí)驗(yàn)材料，研究了在ABA誘導(dǎo)擬南芥氣孔關(guān)閉過程中，PLD伐1、PA和A虹bohD(F)的關(guān)系。我們使用WT、口

5、護(hù)6D而D，a臼6DlF突變體葉片下表皮為材料，進(jìn)行氣孔開度實(shí)驗(yàn)。通過外源施加ABA、16：o18：2PA和H202，證明PLDal及PA直接調(diào)控著AtrbollD和AtrbohF誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程。用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)了外源施加ABA和16：0—18：2PA時(shí)保衛(wèi)細(xì)胞中RoS的積累情況，表明PLDO【l及PA調(diào)控著A劬ohD和A曲o”誘導(dǎo)的ROs升高總結(jié)，我們發(fā)現(xiàn)磷脂酸PA與№∞PH氧化酶A缸bobD和A1而ohF結(jié)合；鑒定了A仃bo