外膜中NADPH氧化酶在移植性血管病中的作用.pdf

1、移植性血管?。╰ransplant vasculopathy,TV）是一種以移植物血管新內膜形成為主要特點的增殖性血管疾病。器官移植后90％的患者在10年內發(fā)展成TV。近年來，隨著免疫抑制劑的發(fā)展和應用，器官移植后急性排斥反應的發(fā)生得到較好的控制，而器官移植后以移植性血管病為主要表現(xiàn)的慢性排斥反應成為影響移植物長期存活的主要因素。如何有效地減輕移植后血管損傷和提高移植物的長期存活率，是目前器官移植領域的重要課題。TV的血管內膜增生是人們

2、一直關注的焦點，關于其發(fā)生機制的研究多數(shù)都集中在血管中膜平滑肌細胞的增殖并向內膜遷移，以及血管壁炎細胞浸潤、內皮細胞損傷并分泌多種細胞因子，從而促使血管內膜增厚繼而發(fā)生血管腔狹窄。而血管外膜一直被認為是對血管起營養(yǎng)和支持作用的一層結締組織，未引起人們的足夠重視。
　　近些年來，研究者開始關注血管外膜的作用，并發(fā)現(xiàn)外膜在動脈粥樣硬化形成、動脈球囊損傷等病變中發(fā)揮重要作用。并有研究證明，當血管受到細胞因子和牽拉、機械損傷等刺激后，外膜

3、的成纖維細胞可以被激活，發(fā)生表型轉化、增殖和遷移能力增強等改變，參與了血管的重構。說明血管外膜在涉及血管重塑的疾病中有重要作用。
　　另外，NADPH氧化酶在心血管疾病中的重要作用已有很多報道，如動脈粥樣硬化病灶的形成和發(fā)展與NADPH氧化酶的活性密切相關。而且有研究者證明，NADPH氧化酶參與外膜成纖維細胞的氧化應激，進而使外膜成纖維細胞被激活，繼而誘導血管重塑的發(fā)生。
　　然而，NADPH氧化酶在血管外膜中的表達以及如何

4、在外膜中發(fā)揮作用，引起移植性血管病的發(fā)生、發(fā)展，少有人研究。本課題主要就外膜中NADPH氧化酶、外膜炎癥及外膜血管新生對血管重構的作用進行探討和研究。
　　研究目的:
　　建立大鼠胸-腹主動脈移植模型，通過體內外實驗驗證移植性血管病起始于外膜的激活，外膜成纖維細胞中NADPH氧化酶在蛋白和mRNA水平上的高表達，促進了外膜成纖維細胞增殖、遷移能力的變化，探討血管外膜以及外膜成纖維細胞激活在移植性血管病新內膜形成及發(fā)展中的作用

5、及外膜炎癥和新生血管的生成對新生內膜可能的促進作用。
　　研究方法:
　　體內實驗:取F344雄性大鼠的胸主動脈為供體血管，用袖套管技術移植到Lewis雄性大鼠腹主動脈建立實驗模型，移植血管作為實驗組，未移植F344雄性大鼠胸主動脈作為正常對照組。移植實驗組于血管移植后0.5，3，7，14天，分別取出移植的胸主動脈進行HE染色，測量移植血管的內膜、中膜、外膜增生情況及內膜/中膜厚度比值。免疫組織化學染色檢測p47phox和g

6、p91phox及CD68和CD3的表達。分離血管外膜組織，用QRT-PCR方法在mRNA水平上檢測移植實驗組0.5，3，7，14天各時間點血管外膜gp91phox和p47phox的表達。
　　體外實驗:分離雄性F344胸主動脈外膜及F344-Lewis移植14天血管外膜成纖維細胞分別做原代培養(yǎng)。取原代細胞培養(yǎng)的3-5代細胞進行實驗。比較兩種細胞增殖和遷移能力的差別;QPCR比較兩種原代成纖維細胞的p47phoxmRNA的表達水平。

7、p47phox-siRNA特異性敲除p47phox后觀察細胞功能的變化:將移植14天血管外膜原代成纖維細胞分成三組，空白對照組（未轉染組），陰性對照組及p47phox-siRNA轉染組，對三組細胞分別進行Brdu染色檢測細胞增殖、transwell小室實驗檢測細胞遷移能力;Diapocynin抑制NADPH氧化酶后觀察細胞功能的變化:移植14天血管外膜原代成纖維細胞分成空白組，DMSO組（對照組）及Diapocynin組，CCK-8檢測

8、三組細胞增殖能力，transwell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力。
　　研究結果:
　　1.移植血管外膜增生先于新內膜形成HE染色結果顯示，與正常對照組比較，移植血管組各時間點的外膜從3天開始明顯增厚，7天繼續(xù)增厚，14天增厚更為明顯;內膜從7天開始增厚，14天增厚明顯;而中膜的厚度在0.5天、3天、7天、14天各時間點無顯著差異。
　　2.移植血管外膜中NADPH氧化酶的表達上調免疫組化結果顯示，gp91phox與p

9、47phox的陽性細胞最早出現(xiàn)在移植后3天的動脈外膜，并隨時間延長表達逐漸增多;移植后7天內膜開始出現(xiàn)gp91phox與p47phox的陽性細胞，14天繼續(xù)增多。QPCR結果表明與正常對照組比較，移植血管外膜的gp91phox和p47phox的mRNA的表達水平從3天開始隨著移植天數(shù)的延長而逐漸增高，并有統(tǒng)計學意義。
　　3.移植血管外膜中炎細胞的浸潤單核-巨噬細胞移植后3天即在外膜中出現(xiàn)，7天和14天隨時間延長逐漸增多;單核-巨

10、噬細胞在移植后7天出現(xiàn)在內膜，14天較7天增多。T細胞數(shù)在血管移植后隨移植天數(shù)的延長無顯著差異。
　　4.抑制移植血管外膜成纖維細胞中NADPH氧化酶表達，細胞增殖遷移能力下降移植14天血管外膜原代成纖維細胞轉染p47phox-siRNA和Diapocynin干預，細胞的增殖和遷移能力均明顯受到抑制。
　　5.血管外膜中新生血管形成與新內膜形成相關移植后3天血管外膜中未發(fā)現(xiàn)新生血管，移植后7天新生血管開始出現(xiàn)，14天明顯增多