NADPH氧化酶與血管重建術(shù)后再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討NADPH氧化酶在血管壁活性氧(ROS)生成和再狹窄過(guò)程中的變化，及其與血管壁細(xì)胞增殖、凋亡以及再狹窄的關(guān)系，為進(jìn)一步通過(guò)調(diào)控NADPH氧化酶-ROS的途徑防治再狹窄提供理論依據(jù)。 方法：本研究分三部分。第一部分通過(guò)兔血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)原代培養(yǎng)，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度過(guò)氧化氫(H<,2>O<,2>)對(duì)VSMC活力的影響;100μmol／LH<,2>O<,2>作用后不同時(shí)段，流式細(xì)胞儀檢測(cè)VSMC細(xì)胞內(nèi)超

2、氧陰離子(·O<,2><'一>)生成；逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)VSMC NADPH氧化酶催化亞基p22phox和nox mRNA表達(dá)的變化。第二部分體內(nèi)構(gòu)建兔髂動(dòng)脈二次損傷后再狹窄模型，RT-PCR檢測(cè)二次損傷后不同時(shí)段兔髂動(dòng)脈p22phox和nox mRNA表達(dá)的變化；原位雜交觀察p22phox和nox mRNA表達(dá)在血管壁的定位。第三部分體外培養(yǎng)兔VSMC，100μmol／L H<,2>O<,2>作用細(xì)胞不同時(shí)段后，

3、Annexin v-PI標(biāo)記檢測(cè)VSMC細(xì)胞凋亡；Westernblot和實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析VSMCNADPH氧化酶調(diào)節(jié)亞基Racl蛋白和mRNA的變化。 結(jié)果：①隨H<,2>O<,2>濃度增加，VSMC細(xì)胞活力逐漸下降，濃度≥30μmol／L時(shí)，各時(shí)段吸光度值即有顯著降低(p<0.05)。②100μmo1/L H<,2>O<,2>作用VSMC6、12、24、48h后，VSMC細(xì)胞內(nèi)·O<,2><'－>生成，與正常對(duì)照組

4、(DHE陽(yáng)性細(xì)胞百分率7.55％)相比，差異有顯著性(p<0.01)，其作用在24h達(dá)峰值(DHE陽(yáng)性細(xì)胞百分率24.01％)。③100μmol／LH<,2>O<,2>作用VSMC 0.5、1、2、4、6h后，與對(duì)照組相比，VSMC p22phox mRNA的表達(dá)顯著增加p<0.05)，并在1h達(dá)峰值；gp91phox和noxl mRNA的表達(dá)下降，尤其noxl，與對(duì)照組比較，1、2、4、6h組noxl mRNA表達(dá)顯著下降p<0.05

5、)。④再狹窄兔髂動(dòng)脈p22phox mRNA的表達(dá)在二次損傷即刻即處于高水平，術(shù)后1d略有下降后又逐漸升高，并在14、28d達(dá)峰值；gp91phox mRNA的表達(dá)在二次損傷后逐漸上升，在14d、28d達(dá)到峰值，與術(shù)后即刻組比較，差異有顯著性(p<0.01)。⑤在二次損傷后，各時(shí)段血管壁p22phox和gp91phox mRNA均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)主要位于新生內(nèi)膜和外膜。⑥與正常對(duì)照組比較(凋亡細(xì)胞百分率4.96％)，H<,2>O<,

6、2>處理4h后VSMC細(xì)胞凋亡百分率(25.96％)顯著升高(p<0.01)。⑦100μmol／L H<,2>O<,2>作用VSMC 0、15、30、60、120、240min后，VSMC Racl蛋白表達(dá)逐漸升高，并在120min達(dá)峰值；與正常對(duì)照組比較，60、120、240min組RacI蛋白表達(dá)升高具有顯著性(p<0.05)，同時(shí)Racl rnRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。 結(jié)論：①一定濃度的外源性H<,2>O<,2>可促進(jìn)VS

7、MC生成O<,2><'->，同時(shí)誘導(dǎo)VSMC活力下降，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。②NADPH氧化酶不同亞基對(duì)血管壁細(xì)胞的影響呈多樣性，p22phox可能主要參與ROS的生成，nox在再狹窄過(guò)程中可能與血管壁細(xì)胞增殖，新生內(nèi)膜形成有關(guān)。⑧NADPH氧化酶在再狹窄血管內(nèi)膜和外膜的高表達(dá)，提示該酶主要在外膜與新生內(nèi)膜發(fā)揮作用。④H<,2>O<,2>誘導(dǎo)VSMC，細(xì)胞凋亡同時(shí)VSMC Racl蛋白表達(dá)升高，后者參與VSMC生成O<,2><'->，并可能通過(guò)