22994.基于內(nèi)切酶特異性剪切作用的疾病dna電化學(xué)分析方法研究

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對(duì)本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名；邙喀卿日期跏J彤學(xué)位論文使用授權(quán)聲明研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬南京師范大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存本學(xué)位論文的電子和紙質(zhì)文檔

2、，可以借閱或上網(wǎng)公布本學(xué)位論文的部分或全部?jī)?nèi)容，可以采用影印、復(fù)印等手段保存、匯編本學(xué)位論文。學(xué)?？梢韵驀?guó)家有關(guān)機(jī)關(guān)或機(jī)構(gòu)送交論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱。(保密論文在解密后遵守此規(guī)定)保密論文注釋：本學(xué)位論文屬于保密論文，保密期限為年。學(xué)位論文作者簽名：未|＼球卿日期：曲，，jJ≯指導(dǎo)教師簽名：j芝≥吃際，日期3為77，八沖—————型一煳炒———__l______—__I?！?。。____—___I。___‘oo’’

3、‘’10’。。‘’’‘?！??！！??！畂。?！?。。。。1。1。1。。’———1——一l，J●’●I●●一二==中文摘要隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的不斷發(fā)展、生活水平的不斷提高，人們對(duì)自身健康的要求也越來越高，但各種疾病仍是危害人類健康的重要因素之一，它的發(fā)病和死亡率上升已引起人們的普遍關(guān)注，對(duì)各種疾病進(jìn)行早期診斷和治療對(duì)于提高疾病患者的生存率具有十分重要的意義。因此，早期診斷和療效觀察方法的研究已成為疾病防治研究領(lǐng)域的重要前沿課題之一。本

4、論文旨在建立某些疾病DNA的電化學(xué)檢測(cè)新方法，為某些疾病的臨床診斷和療效觀察提供快速、準(zhǔn)確和靈敏的方法。主要研究思路是將設(shè)計(jì)的探針DNA固定在適合的電極表面，然后將特定的電化學(xué)指示劑通過共價(jià)鍵合或特性吸附作用固定到探針DNA上；使探針DNA與具有特定疾病基因特征的DNA片段雜交，再經(jīng)特異性內(nèi)切酶作用后，記錄指示劑分子電化學(xué)信號(hào)的變化，從而檢測(cè)疾病DNA。本論文工作主要以丙型肝炎病毒(HCV)和DNA甲基化引起的惡性疾病基因?yàn)檠芯繉?duì)象，建

5、立HCV的電化學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)DNA甲基化檢測(cè)、DNA甲基化酶活性分析以及與DNA甲基化相關(guān)抗癌藥物的篩選。主要內(nèi)容如下：1利用限制性內(nèi)切酶對(duì)特定DNA序列的特異性識(shí)別和剪切作用，建立了一種HCV特異性分析和檢測(cè)的電化學(xué)方法。該方法是將電化學(xué)指示分子硫堇(Thionine)標(biāo)記的特定序列DNA探針固定在Au電極表面，與目標(biāo)cDNA(該目標(biāo)cDNA與HCV的DNA序列有關(guān))進(jìn)行雜交，然后經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHl剪切。剪切后，電化學(xué)指示分子

6、硫堇的電化學(xué)響應(yīng)電流減小或消失，電流減小的幅度(AD與雜交的目標(biāo)cDNA濃度有關(guān)，因而可實(shí)現(xiàn)HCV的電化學(xué)檢測(cè)與分析。我們對(duì)各種可能影響檢測(cè)的因素進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果表明，在最佳條件下，越與目標(biāo)cDNA在O125Imaol／L濃度范圍內(nèi)里線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為002VmoYL(S／N=3)。并且，該方法能靈敏地分辨出完全互補(bǔ)和只有一個(gè)堿基錯(cuò)配的目標(biāo)cDNA，具有好的選擇性，并且能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。2在前面的研究基礎(chǔ)上，選用氧化還原可逆特性較

7、好的羧基二茂鐵(FcA)作為電化學(xué)指示分子，研究了所建立方法對(duì)HCV的電化學(xué)檢測(cè)作用，目的是進(jìn)一步提高HCV的檢測(cè)靈敏度，降低其檢測(cè)限。該方法是先將特定序列的探針DNA固定在Au電極表面并經(jīng)電化學(xué)指示分子FcA標(biāo)記，再與目標(biāo)cDNA(該目標(biāo)cDNA與HCV的DNA序列有關(guān))進(jìn)行雜交，然后被限制性內(nèi)切酶BamHI剪切，根據(jù)氧化還原指示分子FcA的微分脈沖伏安(DPV)峰電流的變化(世)進(jìn)行檢測(cè)。用循環(huán)伏安及交流阻抗方法對(duì)探針DNA在Au電