土耳其斯坦東畢吸蟲cDNA文庫的構(gòu)建及原肌球蛋白基因的克隆和表達.pdf

1、東畢吸蟲病(orientobilharziasis)是由東畢屬吸蟲寄生于牛、羊等多種動物的門靜脈和腸系膜靜脈內(nèi)引起的一種血吸蟲病,其尾蚴也可感染人類引起尾蚴性皮炎(cercarial dermatitis),是一種重要的人獸共患寄生蟲病.中國以土耳其斯坦東畢吸蟲為主,該病在中國分布廣泛,常呈地方和季節(jié)性流行,嚴重危害人們的健康并給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失.由于東畢吸蟲感染人后特殊的發(fā)育過程,從而引起了人們廣泛關(guān)注.目前東畢吸蟲研究相對滯后

2、于曼氏、日本血吸蟲,因此深入研究東畢吸蟲就顯得尤為重要.該文利用SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲cDNA文庫.采用RT-PCR結(jié)合RACE和己構(gòu)建的cDNA文庫克隆了土耳其斯坦東畢吸蟲原肌球蛋白(tropomyosin,TM)基因,提交GenBank,登錄號為AY560898.TM部分編碼序列亞克隆至原核表達載體pET28a(+),重組質(zhì)粒pET28-TM在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導表達出可溶性融

3、合蛋白,其分子量為37.5KDa左右,利用Ni-NTA親和層析純化目的蛋白.Western blotting結(jié)果表明純化蛋白可以識別自然感染東畢吸蟲的山羊血清;將純化蛋白與法國Montanide ISA 206佐劑等體積混合免疫家兔,并收集血清到免疫后第10周.Western-blotting結(jié)果表明純化蛋白可以被特異性免疫后血清識別,表明純化蛋白可以刺激實驗兔產(chǎn)生抗TM抗體.ELISA結(jié)果表明抗體在第5周時達到峰值,從第7周到第10周