偶蹄動(dòng)物朊蛋白基因結(jié)構(gòu)特征及其重組蛋白抗原性的研究.pdf

1、朊粒病(priondisease)是一類遺傳性、傳染性或散發(fā)性的致死性神經(jīng)變性疾病，其中牛海綿樣腦病(BSE)、綿羊癢病(scrapie)和人克-雅氏病(CJD)是最為關(guān)注的朊粒病，其始終涉及一個(gè)宿主常染色體PrP基因編碼的細(xì)胞型PrP(PrpC)經(jīng)轉(zhuǎn)譯后修飾而被轉(zhuǎn)變成致病型PrP(Prpsc)的過程。雖然對(duì)朊粒病的傳染性、遺傳性有所認(rèn)識(shí)，但至今對(duì)正常朊蛋白的生理功能、朊粒病傳染的種間屏障、朊粒增殖、朊粒構(gòu)象轉(zhuǎn)變等機(jī)制還不完全清楚，這嚴(yán)

2、重制約著對(duì)朊粒病發(fā)病機(jī)理和朊粒致病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。本研究的主要目的是為偶蹄動(dòng)物朊蛋白基因變異性和多態(tài)性的遺傳規(guī)律、氨基酸變異與其蛋白構(gòu)象變化的關(guān)系、種間屏障的遺傳學(xué)基礎(chǔ)等研究提供實(shí)驗(yàn)材料和理論依據(jù)并建立實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，進(jìn)行了下述研究和結(jié)果討論。 分別從9頭牛(牦牛，荷斯坦牛和秦川黃牛各3頭)、6只羊(藏綿羊和山羊各3只)、4峰雙峰駝和1只馬麝的全血中提取基因組總DNA，用所設(shè)計(jì)特異引物以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出朊蛋白基因，并克隆到p

3、MD18-T載體。序列分析表明所克隆的PrP基因片段大小分別為：?；?95bp，綿羊、山羊和馬麝基因771bp，雙峰駝基因768bp、792bp和795bp，均為包含在單一外顯子內(nèi)的完整開放閱讀框，與國外報(bào)道的同種、同屬或同科動(dòng)物PrP序列基本相同。這些PrP基因含有6個(gè)或5個(gè)短而富含G-C的重復(fù)元件，可編碼八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或九肽Pro-Gln/rHis-Gly-Gly-Gly-Gly

4、-Trp-Gly-Gln，?；蚝?個(gè)重復(fù)元件(4個(gè)八肽重復(fù)和2個(gè)九肽重復(fù))，綿羊、山羊和馬麝基因含5個(gè)重復(fù)元件(3個(gè)八肽重復(fù)和2個(gè)九肽重復(fù))，雙峰駝的2個(gè)基因克隆含6個(gè)重復(fù)元件(4個(gè)八肽重復(fù)和2個(gè)九肽重復(fù))而另2個(gè)基因克隆含5個(gè)重復(fù)元件(4個(gè)八肽重復(fù)和1個(gè)九肽重復(fù))；其氨基酸序列含有24個(gè)氨基酸的N-端信號(hào)肽和23個(gè)氨基酸的C-端信號(hào)肽(除3個(gè)雙峰駝基因含22個(gè)氨基酸的C-端信號(hào)肽外)。牦牛、雙峰駝和馬麝P(guān)rP基因序列在國內(nèi)外未見報(bào)道

5、。 就以上動(dòng)物PrP基因的核苷酸和其推導(dǎo)氨基酸序列同源性和變異比較分析可見，牛PrP基因間核苷酸和氨基酸序列的同源性分別在99.0﹪～100.0﹪和99.2﹪～100.0﹪之間，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)堿基替換，其中5個(gè)替換引起氨基酸突變。發(fā)現(xiàn)牦牛朊粒基因在126(A→G)、234(G→A)和678(T→C)位的特征性核苷酸替換，但均為同義碼替換；綿羊和山羊PrP基因間核苷酸和其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別在99.0～100.0﹪和98.1～

6、100.0﹪之間，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)堿基替換，其中11個(gè)為異義突變。6個(gè)綿羊和山羊PrP基因均為密碼子136、154和171的PrPARQ等位基因；雙峰駝PrP基因間核苷酸和其推導(dǎo)氨基酸序列同源性在91.0﹪～100.0﹪和94.2﹪～100.0﹪之間，共存在133個(gè)堿基替換，其中26個(gè)為異義突變；馬麝prpC與白尾鹿(white-taileddeer)和麋鹿(reddeer)的PrP基因相比，其核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為97.4﹪、

7、97.9﹪和98.1﹪、97.7﹪，共發(fā)生15個(gè)堿基替換，其中5個(gè)為異義突變。 分別利用DNAstar和Clustalx程序及treev32軟件進(jìn)行PrP基因序列的同源性分析、多重排比和構(gòu)建進(jìn)化樹，并對(duì)其變異與結(jié)構(gòu)、功能和種間屏障的關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系作了比較和描述。22種偶蹄動(dòng)物的PrP基因大小有所差異，為768～795bp，可編碼255～264個(gè)氨基酸的朊蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性，偶蹄動(dòng)物間≥88.6﹪和≥93.3﹪

8、，反芻動(dòng)物間≥95.4﹪和≥96.5﹪。雖然駱駝屬內(nèi)的核苷酸和氨基酸序列同源性≥90.6﹪和≥94.2﹪，但同屬動(dòng)物間分別≥99.0﹪和≥98.8﹪。表明PrP基因在偶蹄動(dòng)物內(nèi)是一個(gè)保守基因。共發(fā)現(xiàn)40個(gè)點(diǎn)突變和2個(gè)突變區(qū)，包括32個(gè)低突變位點(diǎn)、8個(gè)高突變位點(diǎn)、1個(gè)高突變區(qū)和1個(gè)低突變區(qū)，其中有5個(gè)為多態(tài)性突變位點(diǎn)。在N-端柔韌無序“尾”區(qū)(25～135)以八肽重復(fù)缺失為主，球形結(jié)構(gòu)域區(qū)(136～241)以點(diǎn)突變?yōu)橹?，點(diǎn)突變主要簇聚在S

9、1β-折疊前的柔韌無規(guī)卷曲區(qū)的C-端部分和HCα-螺旋內(nèi)。氨基酸104～135區(qū)和球形結(jié)構(gòu)域區(qū)的氨基酸變異性，在偶蹄動(dòng)物(反芻動(dòng)物)間分別為18.8﹪(15.6﹪)和19.8﹪(11.3﹪)，存在于這2個(gè)區(qū)域內(nèi)8個(gè)高突變位點(diǎn)可能是影響分子間相互作用、形成朊粒病傳染種間屏障的主要位點(diǎn)。已知PrP肽基元和功能位點(diǎn)如芳烴回文序列基元、2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)、2個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸硫化位點(diǎn)、形成二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸以及GPI錨錨著點(diǎn)絲

10、氨酸為偶蹄動(dòng)物所共有，顯示偶蹄動(dòng)物各種間變異體的各結(jié)構(gòu)模式非常一致，物種間各氨基酸變異并不影響PrP的主要結(jié)構(gòu)和功能。進(jìn)化關(guān)系分析，可將偶蹄動(dòng)物PrP基因區(qū)分為3大類，反芻動(dòng)物PrP基因分為3小類。令人意外的是，2個(gè)雙峰駝PrP基因的進(jìn)化關(guān)系與牛屬動(dòng)物基因同源。 應(yīng)用重組DNA技術(shù)，正確地構(gòu)建了牦牛和雙峰駝重組朊蛋白的4個(gè)表達(dá)載體，即pGEX-BoPrP(23～242)、pGEX-BoPrP(100～242)、pGEX-CaPr

11、P(25～241)和pGEX-CaPrP(93～241)。經(jīng)轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，成功地獲得了重組E.coliGST-BoPrP(23～242)、GST-BoPrP(100～242)、GST-CaPrP(25～241)和GST-CaPrP(93～241)，分別可表達(dá)的預(yù)期大小約為50.2ku、41.7ku、49.9ku和42.6ku的融合蛋白。各重組菌經(jīng)1.0mmol/LIPTG于37℃誘導(dǎo)5～6h可產(chǎn)生表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白

12、量的30﹪～45﹪的融合蛋白。免疫印跡檢查，除融合蛋白GST-BoPrP(100～242)外，融合蛋白GST-BoPrP(23～242)、GST-CaPrP(25～241)和GST-CaPrP(93～241)可與抗牛單克隆抗體4C1l反應(yīng)，顯示中國黃牛PrP與牦牛和雙峰駝PrP具有共同的抗原成分。 以牦牛重組成熟PrP(23～242)為免疫原，皮下注射BALB/c小鼠，經(jīng)4次免疫后，心臟采血分離抗血清。經(jīng)Westernblott