17795.嗜熱菌中ng802中l(wèi)ada的體外定向進化及facl的功能鑒定

1、南開大學博士學位論文嗜熱菌中NG802中LadA的體外定向進化及Facl的功能鑒定姓名：董焱鵬申請學位級別：博士專業(yè)：微生物學指導教師：馮露201205摘要型LadA相比，突變酶活性(‰。t)提高234倍，其中F146N／N376I具有最高活性；催化效率(‰卅‰)提高了19127倍，其中F146E／N376I和A102E提高最多。對突變酶的最適反應溫度，最適反應pH，熱穩(wěn)定性及底物范圍等酶學性質進行了研究。表達LadA突變體的Pseud

2、omonasfluoresce，zsKOB2A1菌株比表達LMA野生型酶的KOB2A1菌株在以十六烷為唯一碳源和能量來源的培養(yǎng)基中生長快，從而在體內驗證了LadA突變體的活性。對通過易錯PCR技術得到的3個突變酶進行氨基酸置換。運用計算機模擬進行同源模建，進一步研究了酶活性提高與結構變化之間的關系。本研究得到的突變體在石油污染治理和原油開發(fā)等生物過程中具有很大的應用潛力。二長鏈脂肪酸輔酶A連接酶Fatl的功能鑒定本研究對NG802長鏈烷

3、烴降解途徑中第四步的兩個長鏈脂肪酸輔酶A連接酶(Facll和Facl2)基因GTNG0892和GTNG1447進行了克隆表達和體外功能鑒定。Facll在大腸桿菌中的表達產物分別為同二聚體，Facl2在大腸桿菌中的表達產物為非球狀單體或同二聚體。Facll和Facl2均可以催化c2到C30的脂肪酸，Facll的最適底物是癸酸，Facl2的最適底物是棕櫚酸。Facll和Facl2最適反應溫度為均為60℃，最適反應pH均為75，且需要ATP作

4、為輔因子。對Facll和Facl2的熱穩(wěn)定性進行了分析。同時分析了金屬離子，EDTA，SDS和TritonX100對酶活的影響。實時定量PCR顯示，當NG802在以原油為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長時，fadl和facl2的mRNA水平發(fā)生了上調。本研究對NG802中其余5個Facl酶也進行了克隆表達和功能鑒定。發(fā)現這5個Facl酶不能降解鏈長超過C14的脂肪酸，因此，可以確定Facll和Facl2催化長鏈烷烴降解途徑中第四步反應。這是在細菌