嗜熱菌NG80-2芳香烴羥化酶基因的克隆表達和功能鑒定.pdf

1、嗜熱脫氮芽胞桿菌 Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 是從我國大港油田分離得到的目前世界上唯一已知的嗜熱(最適生長溫度為65度) 并具有降解重質(zhì)烷烴能力的采油微生物。其基因組全長3.55Mb，包含一個57.7kb 質(zhì)粒，共編碼3499個基因。 原油是一種由長鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和一些含硫、氮的化合物組成的復雜混合物，其中芳香類化合物種類繁多，多數(shù)芳香化合物對普通細菌都有抑制性和毒性，是

2、一類很難降解的致癌環(huán)境污染物；部分芳香類化合物含硫、氮，影響原油質(zhì)量并造成環(huán)境污染。研究芳香類化合物的降解，對于提高原油質(zhì)量、消除污染、降低石油工業(yè)成本都具有巨大的應(yīng)用價值；并且，利用微生物降解環(huán)境中芳香類污染物，是當前生物修復技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點之一。 在完成該菌株全基因組序列破譯、注釋和利用生物信息學手段分析預測該菌株所有相關(guān)的芳香類化合物降解基因基礎(chǔ)之上，本文論述了利用分子生物學和生物化學等方法對其中的鄰氨基苯甲酸降解途徑中

3、羥化酶基因進行克隆、表達和功能鑒定，為揭示NG80-2的芳香類化合物降解途徑提供了有力證據(jù)；同時，該途徑是在細菌中發(fā)現(xiàn)的一種新的降解途徑，編碼鄰氨基苯甲酸降解基因簇屬NG80-2 基因組通過掃描發(fā)現(xiàn)的可能的外源基因片斷，外源基因的獲得可能與地下的油藏環(huán)境中養(yǎng)分組成有關(guān)，經(jīng)過適應(yīng)性進化使NG80-2獲得了這種新的代謝途徑，并為其提供氮源和能源，該研究為NG80-2對環(huán)境的耐受性和適應(yīng)性以及進化的探索提供了有利的依據(jù)。 通過生物信息

4、學的分析結(jié)合文獻報道，預測了NG80-2中鄰氨基苯甲酸降解基因簇和降解途徑，鄰氨基苯甲酸降解基因簇長約 13kb，除前四個基因外，其它基因與己報道的Pseudomonas fluorescens KU-7降解硝基苯甲酸途徑的基因簇有一定的相似性。用熒光定量PCR的方法分析了基因的表達情況，確定了該基因簇中orf××60屬于芳香化合物羥化酶基因。NG80-2能夠以鄰氨基苯甲酸為唯一碳源生長，其全細胞酶活反應(yīng)結(jié)果證明：在60℃時該菌能降解鄰

5、氨基苯甲酸，其降解速率為0.5mM鄰氨基苯甲酸/克干重細胞/小時，但不能降解硝基苯甲酸。利用pET表達系統(tǒng)在Ecoli BL21中表達了羥化酶及輔酶基因，并確定了最適表達條件為0.1mM IPTG，誘導溫度45℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，并在體外反應(yīng)中檢測了羥化酶活性。進一步對純化的羥化酶進行了酶學性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)羥化酶必需有還原型輔酶為供氫體；該酶反應(yīng)的最適溫度為60℃，反應(yīng)的最適pH為pH7.5；該酶在20 mmol/L，Kpi B