嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定超氧化物歧化酶的純化及基因克隆和表達.pdf

1、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，簡稱SOD)(EC．1.15．1.1)系一類金屬酶，廣泛存在于生物體中。它能夠催化超氧陰離子(O<,2>)發(fā)生歧化反應，從而清除超氧陰離子。在生物體防御氧化損傷的過程中，發(fā)揮著重要作用。根據(jù)酶分子中所含金屬輔基的不同，超氧化物歧化酶主要可分為CuZn-SOD(存在于真核生物中)，Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物中)，F(xiàn)e-SOD(存在于原核生物和高等植物的葉綠體中)等類型。

2、Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸組成相似，可能起源于同一祖先。 嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)是一種廣泛分布的，生長上限溫度較高的嗜熱真菌，從該菌中己分離了多種嗜熱酶，但未見超氧化物歧化酶的報道。本研究中C thermophilum在含干酪素的合成培養(yǎng)基中生長產(chǎn)生超氧化物歧化酶，通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析、Phenyl-Sepharose疏水層析等步

3、驟獲得了凝膠電泳條帶均一的超氧化物歧化酶。 分別用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的方法和SephacrylS-100凝膠過濾層析的方法，測定出本研究所獲得的超氧化物歧化酶的分子量分別為23.5kDa和94.4kDa，證明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一種由4個相同的亞基所構(gòu)成的蛋白質(zhì)。本研究所得到的超氧化物歧化酶的反應最適pH值為7.5，酶的反應最適溫度為60℃。在pH值為7.5的條件下，該酶在50℃和60℃

4、時保溫1h是基本穩(wěn)定的，在70℃時保溫1h后，仍保留有60％的酶活性；在80℃時，酶的半衰期約為25min。 C thermophilum超氧化物歧化酶(Mn-SOD)N-端10個氨基酸序列為KATLPDLKYD，與Aspergillusllys fumigatus和Paracoccidioides brasiliensis超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的N-端氨基酸序列有較高的同源性。 根據(jù)超氧化物歧化酶的氨基酸保守序

5、列設計兼并引物，克隆了Cthermophilum熱穩(wěn)定超氧化物歧化酶CuZn-SOD和Mn-SOD的基因，隨后提取C thermophilum的基因組DNA，克隆了CuZn-SOD DNA序列，該序列包含三個內(nèi)含子區(qū)域。這三個基因在GenBank中的注冊號分別為DQ493760、EF569987、DQ683184。 將超氧化物歧化酶的基因czl與酵母表達載體pPIC9K用EcoR I和Not I雙酶切后體外連接構(gòu)建了酵母分泌型表