Sulfolobus solfataricus P2中的（+）γ-內酰胺酶的半理性定向進化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、來源于Sulfolobus solfataricus P2(+)γ-內酰胺酶(Sslact)是一種理想的生物催化劑，催化（±）γ-內酰胺的水解反應并產生(-)γ-內酰胺，一種能夠用來合成抗艾滋病藥物abacavir的藥物中間體。
　　采用同源建模和分子動力學模擬的方法構建Sslact的蛋白質分子模型，并通過結構分析，推測出了催化三聯(lián)體、疏水口袋和對活性中心的框架起重要作用的氨基酸(3RFA)。催化三聯(lián)體中的Ser195的羥基氫原子

2、到底物的羰基氧原子之間的距離d1和Cys145羰基氧原子到底物的氨基氫原子之間的距離d2被認為是用來推測是否可獲得高酶活突變體的兩個重要參數(shù)。我們通過計算機模擬預測了幾個位于疏水結合口袋和3RFA的氨基酸替換，并利用距離評價假說推測出疏水口袋和3RFA的不可變性，最終選擇了遠離活性中心的Va1203、Pro377和Tyr388作為了突變熱點，以期獲得酶活提高的突變體。
　　通過易錯PCR(epPCR)、定點突變(sdm)和定點飽和

3、突變(ssm)這些定向進化方法獲得了一系列突變體，其中包含了幾個酶活提高的陽性突變體V203N、V203Q、Y388H，它們的比酶活分別是418.20 U/mg、373.35 U/mg和1132.87 U/mg，高于野生型菌株(Wild Type/WT)的202.97U/mg。對其結構和酶活的關系進行分析可以發(fā)現(xiàn)這些突變體均能夠分別從不同層面證實了計算機輔助設計的可靠性。
　　為獲得酶活更高的突變體，把兩個突變位點結合起來構建了雙

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