16008.枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究

1、枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究枯草芽孢桿菌基因組最小化的初步研究PreliminarystudyongenomereductioninBacillussubtilis（國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助NSFC21176182）（國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目資助2011CBA008042012CB725203）學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：張雪玉指導(dǎo)教師：陳濤副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一三年六月摘要本論文通過(guò)無(wú)痕基因刪除操作獲得基因組簡(jiǎn)化的枯草芽孢桿菌

2、，以此作為平臺(tái)菌株，考察其核黃素的合成能力的變化?？莶菅挎邨U菌野生株Bacillussubtilis168中引入突變的ribC基因，得到可以合成少量核黃素的B.subtilis168RibC菌株，刪除突變菌株的upp基因得到B.subtilis168RibCΔupp菌株，以此為出發(fā)菌株進(jìn)行基因組簡(jiǎn)化的研究。根據(jù)已有文獻(xiàn)的報(bào)道，確定備選敲除區(qū)域。本文共刪除了包括類似原噬菌體的區(qū)域skin及prophage3、負(fù)責(zé)編碼合成聚酮類次生代謝產(chǎn)物

3、的pks操縱子、原噬菌體SPβ在內(nèi)的的四個(gè)區(qū)域，最終得到了基因組簡(jiǎn)化223.199Kb的BSZ10菌株，敲除的片段大小約占整個(gè)基因組大小的5.3%。研究采用基于upp基因作為負(fù)篩選標(biāo)記的方法進(jìn)行敲除。以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pCU質(zhì)粒作為基礎(chǔ)操作質(zhì)粒，通過(guò)插入待敲除區(qū)域的上下游同源臂構(gòu)建敲除質(zhì)粒，通過(guò)Spizizen轉(zhuǎn)化將敲除質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)兩次單交換得到目的敲除菌株或恢復(fù)型菌株。兩次單交換分別是：第一次是敲除質(zhì)粒與宿主染色體

4、同源區(qū)之間的單交換，敲除質(zhì)粒整合到宿主菌染色體上形成整合子；第二次是整合子分子內(nèi)同源區(qū)之間的同源重組。得到的菌株通過(guò)在5FU基本鹽培養(yǎng)基平板和氯霉素LB平板上點(diǎn)板驗(yàn)證，得到的5FU抗性菌株且氯霉素敏感菌株即正確的敲除菌株。還可進(jìn)一步通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證目的片段的敲除。將得到的簡(jiǎn)化程度不同的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，考察核黃素的合成能力以及菌株的生長(zhǎng)情況。共選取了四株基因組簡(jiǎn)化菌株進(jìn)行發(fā)酵，分別是BSZ5菌株（敲除Pks區(qū)的菌株，基因組減小了74.

5、837Kb）、BSZ7菌株（Skin區(qū)和Pks區(qū)共敲除的菌株，敲除片段大小為121.399Kb）、BSZ8菌株（敲除了Skin區(qū)、Pks區(qū)和Pro3區(qū)，基因組減小了132.199Kb）和BSZ10菌株（敲除了Skin區(qū)、Pks區(qū)和Pro3區(qū)以及部分SPβ區(qū)，基因組減小了223.199Kb）。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比基因組簡(jiǎn)化程度各不相同的菌株生長(zhǎng)速率變化不大，最大OD高于出發(fā)菌株，葡萄糖的消耗速率有所提高，核黃素的合成能力并未受到影響