新生隱球菌莢膜相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、根據(jù)新生隱球菌多聚糖莢膜成分和生化方面的差異,人們將新生隱球菌分成3個(gè)變種,5個(gè)血清型,其中新生變種(血汪型A、D和AD)存在世界范圍的土壤和鳥(niǎo)糞中,與免疫力低下的患者,尤其是愛(ài)滋病患者的隱球菌病有相關(guān)性,而格特變種(血清型B和C)和上海變種(血清型B),嚴(yán)格局限于熱帶和亞熱帶地區(qū),通常引發(fā)免疫正常人的隱球菌病,因此研究新生隱球菌不同的血清型與致病性之間的關(guān)系是重要的流行病學(xué)研究課題.臨床上主要用免疫學(xué)方法檢測(cè)抗新生隱球菌莢膜多聚糖的抗

2、體,對(duì)其進(jìn)行血清分型,但是該法有時(shí)對(duì)某些臨床分離株不能鑒定.盡管已有一些分子生物學(xué)的技術(shù)補(bǔ)充了免疫學(xué)方法的局限性,但是臨床上仍然需要新的、較準(zhǔn)確的和簡(jiǎn)便的方法來(lái)對(duì)新生隱球菌進(jìn)行血清型分型.實(shí)驗(yàn)方法:1.新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP64的克隆和在檢測(cè)病原體方面的意義:根據(jù)瓣生隱球菌(血清型D)CAP64莢膜基因的序列設(shè)計(jì)眾多引物,將引物一一到GenBank進(jìn)行比對(duì),找到特異性最好的引物進(jìn)行研究和驗(yàn)證.2.新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP59最

3、大外顯子的序列分析和在檢測(cè)病原體方面的意義:分析CAP59莢膜缺陷株CAP59基因最大外顯子的序列與其來(lái)源菌株新生隱球菌B-3501相應(yīng)序列的差別,以期發(fā)現(xiàn)該序列中與CAP59基因功能有關(guān)的鹼基變異;通過(guò)分析5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株CAP59基因的最大外顯子序列與D型血清型新生隱球菌CAP59基因的最大外顯子序列的差別,來(lái)探索利用CAP59基因最大外顯子序列區(qū)分5個(gè)血清型新生隱球菌分子生物學(xué)基礎(chǔ)和分析新生隱球菌的種系進(jìn)化關(guān)系.3.新生隱球菌c

4、ap59和CAP64莢膜缺陷株ura突變株的篩選和鑒定:通過(guò)體外基因重組技術(shù),用大多數(shù)酵母都敏感的G418基因插入到新生隱球菌CAP基因莢膜缺陷株1.2Kb URA5基因的特定序列,用電轉(zhuǎn)化將上述的重組片段導(dǎo)入莢膜缺陷株,可定向獲得具有G418抗性的ura5突變株.考慮到新生隱球菌基因的同源整合率非常低,我們同時(shí)用硫酸二己酯化學(xué)誘變劑,對(duì)新生隱球菌CAP59、CAP64和CAP10莢膜缺陷株誘變.4.綠色熒光蛋白GFP基因和CAP基因融

5、合表達(dá)載體的初步構(gòu)建:以轉(zhuǎn)化克魯維酵母的穿酸質(zhì)粒pCXJ18作為基礎(chǔ),將CAP64基因、GFP基因及新生隱球菌的URA5基因順序置于GAL7基因的啟動(dòng)子之下,構(gòu)建了一系列的自主復(fù)制型質(zhì)粒.結(jié)論:1.上游引物P1:5'CTC GTC TTT CTC CTC CAT C3',下游引物P2:5'AGT TGG TAT ATC CGC CTA AG3',擴(kuò)增目的片段大小為2.285kb,該引物是新生隱球菌D型血清型的型特異性引物.2.CAP59

6、缺陷株的CAP59基因最大外顯子序列有明顯突變.3.根據(jù)CAP59最大外顯子序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)約600bp片段進(jìn)行擴(kuò)增,上游引物:P1:5'GAG TGT CTC CGC AAC CCG CA3';下游引物P2:5CCT ACT CTG CCA AAT CAA CTC3'.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血清型新生隱球菌CAP59基因的最大外顯子序列存在差異,可以作為分型和檢測(cè)新生隱球菌病原體的分子生物學(xué)工具.4.A突變株是CAP64莢膜缺陷株的ura5尿嘧啶突