我國107株新生-格特隱球菌的基因型特點及DiversiLab系統(tǒng)在基基因分型中的應(yīng)用.pdf

1、[目的]分析我國107株新生/格特隱球菌的基因型特點，包括84株臨床株和23株環(huán)境株，同時驗證DiversiLab系統(tǒng)用于新生隱球菌和格特隱球菌基因分型的可行性。
　　[方法]回顧性分析2007年至2013年我院與北京地壇醫(yī)院76例隱球菌患者的性別、年齡、來源地、發(fā)病時間、基礎(chǔ)疾病等臨床資料。收集其中一例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者曾去過家庭(H1)的鴿糞標(biāo)本中的新生隱球菌分離株，并采集距離H1約10公里的另一養(yǎng)鴿家庭(H2)的鴿糞標(biāo)本中的

2、新生隱球菌分離株作為對照。使用CHROMagar顯色培養(yǎng)基、API20C AUX、Vitek2 Compact等常規(guī)方法對從上述患者臨床標(biāo)本中分離的84株隱球菌以及從H1、H2鴿糞中分離出的23株新生隱球菌進(jìn)行菌種鑒定，然后用CGB培養(yǎng)基篩選格特隱球菌。使用血清型特異性引物、交配型引物進(jìn)行血清分型及交配型鑒定。使用真菌通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增所有菌株的rDNA ITS。使用URA5-RFLP對上述菌株初步基因分型后，進(jìn)一步PCR擴(kuò)

3、增上述菌株的CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1和URA5等7個基因，進(jìn)行多位點序列分型(MLST)。ITS及MLST7個基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測序。使用MEGA6.06軟件將測試菌株與新生/格特隱球菌參考菌株MLST7個基因的串聯(lián)序列同時比對并構(gòu)建分子進(jìn)化樹。選擇DiversiLab系統(tǒng)Fungal試劑盒對測試菌株和新生/格特隱球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行rep-PCR，使用微流體芯片對rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

4、分離DNA片段，進(jìn)一步使用DiversiLab軟件V3.4.40分別進(jìn)行分類和分型分析。并使用DiversiLab系統(tǒng)對2株同時從該病人腦脊液中分離的新生隱球菌(PU66和PU112)進(jìn)行溯源分析。
　　[結(jié)果]在國際上首次使用DiversiLab系統(tǒng)對84株新生/格特隱球菌臨床株（包括82株新生隱球菌和2株格特隱球菌）、23株新生隱球菌環(huán)境株以及9株新生隱球菌和格特隱球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株共計116株隱球菌進(jìn)行了基因分型，除1新生隱球菌

5、臨床株VNB基因型鑒定有分歧外，其余115株新生/格特隱球菌通過DiversiLab系統(tǒng)分型的結(jié)果與MLST及URA5-RFLP的分型結(jié)果完全一致;發(fā)現(xiàn)了我國乃至亞洲首例VNB基因型新生隱球菌;在我國屬于溫帶氣候的華北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了格特隱球菌。
　　76例隱球菌病患者分別來自我國15個省份和3個直轄市，20例HIV患者的病死率為30％，10例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的病死率為40％，11例患者無明顯基礎(chǔ)疾病，100％存活。84株隱球菌臨

6、床株中有82株新生隱球菌和2株格特隱球菌。82株新生隱球菌中有1株為雜合子，血清型為AD型，其余全為A血清型;雜合子為VNⅢ基因型，另有1株VNB基因型，其余80株為VNⅠ基因型(95％)，為最常見基因型;77株(91.6％)新生隱球菌的MLST序列型為ST5，其次還有ST31、ST63、ST265、ST295、ST296各1株，其中ST265、ST295和ST296是新MLST序列型。2株格特隱球菌的血清型為B/C型，基因型分別為VG

7、Ⅰ和VGⅡ，MLST序列型為ST182和ST332，其中ST332為新序列型。雜合子的交配型為α/α交配型，其余83株新生/格特隱球菌臨床株的交配型全部為α交配型。23株新生隱球菌環(huán)境株全為A血清型，α交配型，VNⅠ基因型。來自H1家庭鴿糞中的11株新生隱球菌及2株臨床株均屬于VNⅠc基因型，MLST序列型除PU112為ST265外均為ST5。而H2家庭鴿糞中分離的12株新生隱球菌均為VNⅠb基因型，MLST序列型為ST31(n=11)

8、和ST297(n=1)。ST297為新MLST序列型。基于ITS序列構(gòu)建的分子進(jìn)化樹顯示VNⅠ、VNⅡ與VNB聚類在一起?；贗GS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示PU146與WM626（VNⅡ，標(biāo)準(zhǔn)菌株）聚類，但PU146經(jīng)URA5-RFLP及MLST分析均為VNⅠ。所有測試菌株及新生/格特隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株使用DiversiLab系統(tǒng)現(xiàn)有的酵母菌和絲狀真菌數(shù)據(jù)庫分類的結(jié)果顯示與最匹配菌株的相似性均低于80％。PU157被MLST分型為VNB，而UR

9、A5-RFLP的結(jié)果為VNⅡ，DiversiLab的分析結(jié)果更接近VNⅠ。另外，MLST不能分析AD血清型（雜合子），但DiversiLab系統(tǒng)分型分析能夠鑒別PU43（AD血清型，臨床株）與WM628（AD血清型，標(biāo)準(zhǔn)菌株），并能與其它7種基因型區(qū)分開來，其余測試菌及新生/格特隱球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DiversiLab分型結(jié)果與URA5-RFLP、MLST的分型結(jié)果完全一致。DiversiLab分析顯示PU66與PU112的相似性為96.7

10、％，并有多處峰的差異。PU66與PU70同源性最高，相似性為99.3％，而所有環(huán)境株與PU112的相似性均低于98.6％。
　　[結(jié)論]DiversiLab系統(tǒng)可快速而準(zhǔn)確地對新生/格特隱球菌進(jìn)行基因分型;新生隱球菌VNⅠ基因型是我國新生/格特隱球菌最為常見的基因型，但我國臨床上和環(huán)境中的新生/格特隱球菌的基因型分布特點有待深入而全方位地進(jìn)一步調(diào)查;URA5-RFLP不能區(qū)分VNB與VNⅡ基因型;ITS、IGS序列分析可以區(qū)分新生