慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)及病毒X基因變異與患者預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全世界的慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者中，我國(guó)約占一半。對(duì)慢性乙型肝炎的基礎(chǔ)研究和臨床診療一直是我國(guó)重點(diǎn)。以往對(duì)HBV的研究主要集中在血清學(xué)方面，由于HBV在血清和肝斷潛在病變和早期纖維化，最終診斷或除外HBV感染方面有著不可替代的作用。目前，肝穿刺活檢已相當(dāng)普遍，但對(duì)肝穿刺結(jié)果的判定、各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)之間的相互關(guān)系及和預(yù)后的聯(lián)系，還缺乏系統(tǒng)性評(píng)估。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，病毒變異在HBV致病與致癌中的作用越來(lái)越引起

2、關(guān)注，特別是X基因及其蛋白。X基因是HBV基因組內(nèi)功能重疊最明顯的區(qū)域，其編碼的X蛋白具有廣組織中其病毒狀態(tài)、抗原的含量、血清型和基因型、病變程度等方面均存在顯著差異，難以直觀地反應(yīng)病變的狀態(tài)和嚴(yán)重程度，所以肝活體組織檢查越來(lái)越成為必要手段，在診泛的反式激活作用，目前被認(rèn)為是研究HBV致病與致癌作用機(jī)制的突破口。以往對(duì)X基因及蛋白變異的研究多采用血清標(biāo)本或在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，與體內(nèi)肝細(xì)胞中的實(shí)際情況有一定差距。肝組織內(nèi)X基因的變異與各組

3、織病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系以及對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸的影響還未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，在對(duì)肝細(xì)胞癌發(fā)生機(jī)制的研究中，抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化越來(lái)越引起人們的關(guān)注。雖然許多研究證實(shí)，肝細(xì)胞癌中p161NK4A的高甲基化可被普遍檢出，且HBV感染能顯著增加肝組織p16n~Knn甲基化比率，從而使p16蛋白低表達(dá)或不表達(dá)，在肝細(xì)胞癌形成早期起了重要作用，但其中的機(jī)制并不明確。最新體外研究提示，HBV的病毒蛋白和病毒變異可能與此過(guò)程有關(guān)，但在人體條件下這種相關(guān)性是否存

4、在，結(jié)果也有待進(jìn)一步證實(shí)。 本研究一方面以較大臨床肝穿刺樣本作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)(如Scheuer評(píng)分、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)和X蛋白(HBx蛋白)的原位表達(dá)，單位肝組織內(nèi)HBVDNA含量)和X基因變異的回顧性研究，明確它們之間的相互關(guān)系及與患者預(yù)后的聯(lián)系，找到可用于肝穿刺活檢的病理輔助診斷指標(biāo)，對(duì)慢性乙型肝炎患者的預(yù)后加以評(píng)估及指導(dǎo)臨床診療；另

5、一方面在組織水平研究了HBV病毒蛋白(包括HBsAg、HBcAg和HBx蛋白)以及X基因的變異與p16INK4A甲基化之間的關(guān)系，為HBV介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌形成機(jī)理的研究提供新方向。 第一部分HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：通過(guò)對(duì)慢性乙型肝炎肝穿刺標(biāo)本中組織病理學(xué)指標(biāo)和患者預(yù)后的回顧性研究，明確各指標(biāo)間的相互關(guān)系及和患者預(yù)后的聯(lián)系。 方法：對(duì)216例肝穿刺活檢病例進(jìn)行預(yù)后隨訪，時(shí)間為

6、2～18年。根據(jù)隨訪結(jié)果，按有無(wú)肝細(xì)胞癌的發(fā)生首先將患者分為兩組：癌變組和非癌變組；非癌變組患者又按有無(wú)肝硬化的發(fā)生分為硬化組和非硬化組；最后非硬化組患者按血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平分為ALT波動(dòng)組和ALT正常組。肝臟病理?yè)p傷程度用Scheuer評(píng)分來(lái)表示；免疫組化EnVision二步法檢測(cè)肝組織HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織內(nèi)HBVDNA的含量。結(jié)果：相關(guān)分析結(jié)果顯示：肝組織內(nèi)

7、HBeAg的表達(dá)與慢性肝炎炎癥分級(jí)(G分級(jí))呈顯著正相關(guān)(P=0．001)；HBx蛋白的表達(dá)與G分級(jí)(P=0．008)和纖維化分期(S分期)(P=-0．002)均呈顯著正相關(guān)。部分指標(biāo)預(yù)后組間也存在差異：硬化組G分級(jí)顯著高于非硬化組(P=0．000)，ALT波動(dòng)組顯著高于ALT正常組(P=0．019)；同樣，硬化組S分期也顯著高于非硬化組(P=0．000)，ALT波動(dòng)組顯著高于ALT正常組(P=-0．001)；肝組織內(nèi)HBeAg(P=-

8、0．005)和HBx蛋白(P=0．024)的表達(dá)在硬化組明顯比非硬化組高。方差分析結(jié)果還顯示HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響具有協(xié)同作用：同一病例中兩者肝組織內(nèi)同時(shí)表達(dá)將大大增加慢性乙型肝炎患者肝硬化的發(fā)生率達(dá)38．46％，而單一HBeAg或HBx蛋白表達(dá)者為15．07％，兩者均陰性者僅為10．81％。多元參數(shù)的最優(yōu)尺度回歸則顯示Scheuer評(píng)分是最重要的判斷預(yù)后的指標(biāo)。 結(jié)論：肝組織內(nèi)HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)與慢

9、性乙型肝炎患者肝臟病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，并顯著增加肝硬化的發(fā)生率；Scheuer評(píng)分是判斷患者預(yù)后的最重要指標(biāo)，其分值越高則患者預(yù)后越差。 第二部分HBVX基因變異與HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和慢性乙型肝炎患者預(yù)后的相關(guān)性研究 目的：研究慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)HBVX基因部分區(qū)段的變異與各組織病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，及其在預(yù)后轉(zhuǎn)歸(特別是肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)生)中的作用。 方法：選取1986～1994年問(wèn)有完整預(yù)后隨訪

10、資料的83例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對(duì)象?；颊甙从袩o(wú)肝細(xì)胞癌和肝硬化的發(fā)生分為3組：癌變組、硬化組和非硬化組。另取20例HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌作為對(duì)照研究。從福爾馬林固定、石蠟包埋組織中抽提DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBVX基因ntl583～1793區(qū)段，目的條帶經(jīng)膠回收后直接雙向測(cè)序。免疫組化EnVision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織HBVD

11、NA含量；數(shù)據(jù)處理采用序列分析軟件和統(tǒng)計(jì)軟件。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)2¨bp，核苷酸突變發(fā)生于：m1632、1633、1635、1636、1652、1673、1674、1719、1726、1727、1730、1752、1762和1764位點(diǎn)，其中錯(cuò)義突變主要出現(xiàn)在X蛋白aa87(m1632、1633)、88(mi635、1636)、¨6(ntl719)、¨8(m1726、1727)、¨9(ntl730)、127(m175

12、2)、130(ntl762)和131(ntl764)位氨基酸。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，檢測(cè)區(qū)段核苷酸突變率和患者慢性乙型肝炎病史呈顯著正相關(guān)(P--O．005)，肝癌病例的突變率顯著高于慢性肝炎(／'=-0．009)；ntl725～1730(aall8／119)突變與肝組織內(nèi)HBcAg顯著低表達(dá)(P=O．006)，和HBVDNA低拷貝數(shù)(P=0．004)明顯相關(guān)，尤以ACTGAC(TD)型突變最為明顯；相反ntl762／1764(aal30／

13、131)位點(diǎn)突變則伴肝組織內(nèi)HBcAg顯著高表達(dá)(P=-0．005)和高水平的HBVDNA含量(／'--0．006)。硬化組和非硬化組中各位點(diǎn)野生型和突變型所占比率均未見(jiàn)顯著性差異；但癌變組m1762／1764(aal30／131)突變率顯著高于非癌變患者(P=0．011)；ntl725～1730(aall8／119)野生型(／'--0．024)和ntl762／1764(aal30／131)突變型(P--O．001)在肝癌組所占比率均明

14、顯高于慢性肝炎。 結(jié)論：m1725～1730(aall8／119)和ntl762／1764(aal30／131)突變可能與肝組織內(nèi)HBcAg的表達(dá)和HBV的復(fù)制有關(guān)。HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌中病毒以高復(fù)制型存在。HBV的突變是一個(gè)逐漸累積的過(guò)程，突變和肝硬化的發(fā)生無(wú)關(guān)，而m1762／1764(aal30／131)突變能顯著增加慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)率。 第三部分HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)和X基因變異與p16~4A甲基化

15、的相關(guān)性研究 目的：通過(guò)研究HBV相關(guān)組織病理學(xué)指標(biāo)及X基因的變異與p16INK4A甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系，明確病毒對(duì)p161NK4A甲基化的影響和其在HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌形成中的作用。 方法：選取23例HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌和25例慢性乙型肝炎肝穿刺活檢病例作為研究對(duì)象，癌與癌旁組織以及肝穿組織中p16INK4A的甲基化狀態(tài)采用甲基化特異性PCR(MSP)進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化EnVision二步法顯示肝組織內(nèi)HBsAg、HBcA

16、g、HBeAg和HBx蛋白的表達(dá)；熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)單位肝組織HBVDNA含量。HBVX基因的變異用PCR擴(kuò)增和直接序列測(cè)定來(lái)檢測(cè)。 結(jié)果：在癌旁組織(／'=0．025)和慢性乙型肝炎(P=0．029)病例中，存在p16INK4A甲基化的病例其肝組織內(nèi)HBx蛋白的表達(dá)明顯高于非甲基化病例。但在肝癌組織中，HBx蛋白的表達(dá)與p161NK4A甲基化無(wú)關(guān)。在所有肝組織中，HBsAg、HBcAg和組織HBVDNA含量均與p16INK