I-Eβ基因與實(shí)驗(yàn)性小鼠膜性腎小球腎炎發(fā)病的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制的研究目前仍停留在體內(nèi)免疫功能紊亂上，且發(fā)病機(jī)制之間尚存在一些相互矛盾之處。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)控制免疫應(yīng)答的基因-Ir基因(immuneresponsegeneI-Eβ片段)進(jìn)行研究，探討其與小鼠膜性腎小球腎炎(membranousglomerulonephritis，MGN)發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，以期論證Ir基因在腎炎發(fā)病中的重要地位和作用，揭示其分子病理學(xué)發(fā)病機(jī)制。 方法：1、復(fù)制與鑒定小鼠膜性腎小球腎炎動(dòng)物模型：

2、按照Border[1]方法，制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(cationicbovineserumalbumin，C-BSA)。選用近交系BLAB/c小鼠30只，20±2g，雌雄對(duì)半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組二組，實(shí)驗(yàn)組隔日尾靜脈注射C-BSA0.2ml，于注藥三周始每周每只檢測(cè)2次小鼠尿蛋白，四周末殺檢，進(jìn)行光鏡、電鏡、免疫熒光染色鑒定。對(duì)照組小鼠隔日注射0.2ml磷酸鹽緩沖溶液(phosphatebufferedsolution，PBS液)

3、，進(jìn)行全程對(duì)照。 2、以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerizechainreaction，RT-PCR)方法擴(kuò)增并鑒定I-Eβ基因：隨機(jī)選取上述膜性腎病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，分別作為檢測(cè)I-Eβ基因序列的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，取每只小鼠脾臟組織50mg，充分搗碎，加入Trizol試劑提取總核糖核酸(ribonucleicacid，RNA)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定光密度(opticalden

4、sity，OD)OD260/OD280的比值，計(jì)算出各組的RNA的濃度與純度，并用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性，利用RT-PCR技術(shù)和隨機(jī)引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)，選取I-Eβ基因cDNA全序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物在PCR儀上進(jìn)行體外擴(kuò)增。以小鼠磷酸甘油醛脫氫酶(gluceraldehydephosphatedehydrogen

5、ase，GAPDH)基因進(jìn)行對(duì)比。 3、設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部特異性引物，以測(cè)序儀檢測(cè)PCR產(chǎn)物，得出I-Eβ基因序列。 4、測(cè)序結(jié)果與DNA序列峰圖核對(duì)后，在BLAST上進(jìn)行雙重序列對(duì)比，以及clustalx1.83多重序列對(duì)比。以雜合突變數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果：1、以Border方法制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白，小鼠尾靜脈注射制備動(dòng)物模型穩(wěn)定可靠； 2、用Trizol試劑提取總RNA，所提RNAOD2一OD28

6、0在1.8～2.0之間，濃度在542.0ng/μl左右。1％瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA電泳圖的5S、18S、28S三條帶型整齊，無(wú)明顯拖尾及彌散，說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯降解。 3、逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有目的基因I-Eβ基因和內(nèi)參對(duì)照GAPDH基因的cDNA產(chǎn)生，PCR產(chǎn)物電泳與脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)分子Marker相比示：擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別在750～1000bp和100～25

7、0bp之間，與預(yù)定理論值849bp和201bp大小符合。 4、PCR產(chǎn)物檢測(cè)序列，送檢20例，其中16例峰圖明顯，雜帶較少，可獲得清晰序列，其序列在BLAST上與正常序列對(duì)比，結(jié)果符合率100％；以clustalx1.83進(jìn)行多重序列對(duì)比，結(jié)果也無(wú)明顯差異性。另外4例雜峰、雜帶突出，無(wú)法辨認(rèn)序列。 5、雜合突變分析顯示：實(shí)驗(yàn)組共測(cè)出堿基3704bp，其中有8bp發(fā)生雜合突變，突變率為1.890‰；對(duì)照組測(cè)出3755bp，

8、其中有1bp發(fā)生雜合突變，突變率為0.266‰。 6、雜合突變情況與PCR擴(kuò)增致突變率1/105比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合Poisson分布，根據(jù)Poisson分布的小概率事件原理，作出統(tǒng)計(jì)推斷，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS11.5forwindows進(jìn)行處理，結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組P(x≥8)=1.11E-16，P遠(yuǎn)小于0.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組雜合突變率高于PCR擴(kuò)增所致突變率，其原因可能為實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生了突變；對(duì)照組P(x≥1

9、)=0.007，P小于0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可認(rèn)為對(duì)照組雜合突變率高于PCR擴(kuò)增所致突變率，其原因可能為對(duì)照組可能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生了突變。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果進(jìn)行四格表X2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5forwindows進(jìn)行處理，結(jié)果X2為5.553，P值為0.018(α＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組雜合突變率高于對(duì)照組，其原因可能與膜性腎病的發(fā)生有關(guān)。7、對(duì)9例雜合突變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組8例突變中

10、，有2例雜合突變同時(shí)發(fā)生在I-Eβ基因β1外顯子第20位堿基上，均為胸腺嘧啶/腺嘌呤(thymine/adenine，T/A)雜合突變。而正常該位點(diǎn)應(yīng)為胸腺嘧啶。對(duì)照組該位點(diǎn)無(wú)突變發(fā)生。進(jìn)一步對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組該位點(diǎn)T峰均有降低。測(cè)出的16例序列，T峰下的干擾峰中12例均有腺嘌呤(adenine，A)干擾峰的出現(xiàn)，其中實(shí)驗(yàn)組6例，占實(shí)驗(yàn)組總測(cè)出例數(shù)的85.71％；對(duì)照組6例，占對(duì)照組66.67％?？梢钥闯鲈撐稽c(diǎn)A堿基干

11、擾峰發(fā)生率實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，由于例數(shù)不多，統(tǒng)計(jì)上無(wú)意義，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。而9例序列該位點(diǎn)干擾峰中7例有胞嘧啶(cytosine，C)的出現(xiàn)，發(fā)生率為77.78％；而實(shí)驗(yàn)組中6例僅有1例有C的出現(xiàn)，發(fā)生率為16.67％，列出四格表，進(jìn)行X2檢驗(yàn)，X2=6.349，P=0.012(α＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可認(rèn)為該位點(diǎn)C干擾峰發(fā)生率實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組。 結(jié)論：1、小鼠I-Eβ基因的分離和鑒定是許多后續(xù)研究的前提。