I-Aβ-,1-基因與實(shí)驗(yàn)性小鼠膜性腎小球腎炎的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：膜性腎小球腎炎(membranous glomerulonephritis，MGN)，又稱(chēng)膜性腎病(membranous nephropathy，MN)，是引起成人腎病綜合征最常見(jiàn)的原因。多數(shù)患者預(yù)后差。MGN的發(fā)病機(jī)制還不甚明了，目前的研究認(rèn)為與免疫反應(yīng)有關(guān)，而和免疫功能密切相關(guān)的是MHC基因。本研究擬對(duì)控制免疫應(yīng)答的Ir基因(immune responsegene)I-Aβ1片斷進(jìn)行研究，探討其與小鼠MGN發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，以期

2、論證Ir基因在腎炎發(fā)病中的重要地位和作用，揭示其分子病理學(xué)發(fā)病機(jī)制。 方法： 1．復(fù)制與鑒定小鼠膜性腎小球腎炎動(dòng)物模型。按照Border[1]方法，制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白(cationic bovineserum albumin，C-BSA)。選用近交系BLAB/c小鼠30只，20±2g，雌雄對(duì)半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組。實(shí)驗(yàn)組隔日尾靜脈注射C-BSA0.2 ml，對(duì)照組小鼠隔日注射0.2 ml生理鹽水(NS)，進(jìn)

3、行全程對(duì)照，于注射第3周起每周檢測(cè)每只小鼠尿蛋白2次，四周末殺檢，進(jìn)行光鏡、電鏡、免疫熒光染色鑒定。 2．以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerize chain reaction，RT-PCR)方法擴(kuò)增并鑒定I-Aβ1基因。隨機(jī)選取上述膜性腎病動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，分別作為I-Aβ1基因序列的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。取小鼠脾臟組織提取總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)

4、，并鑒定RNA的純度和完整性，用RT-PCR技術(shù)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸(complementary deoxyfibonucleic acid，cDNA)，并對(duì)I-Aβ1基因cDNA全序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。 3．設(shè)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部特異性引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。 4．測(cè)序結(jié)果分析。將測(cè)序結(jié)果分別在BLAST上進(jìn)行雙重序列對(duì)比，以及Clustalx1.83多重序列對(duì)比。以雜合突變數(shù)、干擾峰數(shù)及突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

5、。 結(jié)果： 1．以Border法制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白，小鼠尾靜脈注射制備動(dòng)物模型穩(wěn)定可靠。 2．用Trizol試劑提取總RNA，總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，示A260/A280在1.77～1.93之間，提示RNA純度較好；1％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)28s、18s、5s三條帶，28s和18s條帶明亮、清晰，并且28s的亮度在18s條帶的兩倍以上，表明提取的總RNA完整性好。 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)

6、照組目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物與脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)分子Marker相比較示：擴(kuò)增產(chǎn)物大小在300～400 bp之間，與預(yù)期350 bp相符，陰性對(duì)照組(未加cDNA組)無(wú)產(chǎn)物。 4．送檢實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10例PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果送檢20例均峰圖明顯，雜帶較少，可獲得清晰序列，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組序列在BLAST上與正常序列對(duì)比，符合率分別為99.71％和99.94％；將序列文件中序列與DNA

7、序列峰圖對(duì)比，以峰圖為準(zhǔn)，校準(zhǔn)每例標(biāo)本的序列，用Clustalx1.83對(duì)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組以及正常BLAB/c小鼠基因序列進(jìn)行多重序列對(duì)比，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組以及正常小鼠基因序列均一致。 5．雜合突變分析顯示：實(shí)驗(yàn)組突變率為2.578‰，高于PCR擴(kuò)增所致突變率(P<0.01)；對(duì)照組突變率為0.286‰，也高于PCR擴(kuò)增所致突變率(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組突變率明顯高于對(duì)照組(P=0.011<0.05)。

8、 6.對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的干擾峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組干擾峰的發(fā)生率為2.865‰，對(duì)照組為0.572‰，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組更易出現(xiàn)干擾峰(P=0.021<0.05)。7.對(duì)實(shí)驗(yàn)組雜合位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果P=0.436>0.05，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，尚不能認(rèn)為四個(gè)位點(diǎn)之間突變的發(fā)生率有差異。 結(jié)論： 1.小鼠MGN模型建立成功。 2.I-Aβ1基因在實(shí)驗(yàn)性膜性腎病小鼠中雜合突變率和干擾峰出現(xiàn)率均增高，可能和小鼠膜性腎病發(fā)