AIM2誘導(dǎo)固有免疫在乙肝相關(guān)性腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、[背景/目的]
　　乙型肝炎病毒相關(guān)性腎小球腎炎(HBV-GN)是乙型肝炎病毒感染最主要的肝外表現(xiàn)之一。然而HBV-GN的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)研究認(rèn)為與免疫損傷有關(guān)。
　　黑素瘤缺乏因子2(AIM2是最近研究發(fā)現(xiàn)的胞質(zhì)雙鏈DNA傳感器，它能夠識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)的雙鏈DNA并被激活，形成免疫復(fù)合物，通過Caspase-1途徑，促進(jìn)IL-1β與IL-18前體的成熟及分泌，誘導(dǎo)固有免疫反應(yīng)，在機(jī)體抵御病毒、細(xì)菌感染中起重要作用。本研究旨

2、在初步探討AIM2的激活與表達(dá)在HBV-GN發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　[方法]
　　1.于ScienCellResearchLaboratories(California,USA)購買人腎小球系膜細(xì)胞系(HMC)，體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2.將pcDNA3.0-1.1HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)抗性篩選、酶切分析、測(cè)序，鑒定質(zhì)粒。
　　3.設(shè)計(jì)合成針對(duì)人AIM2基因序列特征設(shè)計(jì)特異siRNA-

3、(1＃-3＃)，以陽離子脂質(zhì)體為載體，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞;FAM熒光標(biāo)記，測(cè)定轉(zhuǎn)染率，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)。熒光定量PCR檢測(cè)siRNA抑制AIM2mRNA水平上表達(dá)效果。迸一步通過Westernblot檢測(cè)siRNA抑制AIM2蛋白水平表達(dá)效果。應(yīng)用SPSS17.0軟件分析AIM2在各組表達(dá)的差異，篩選出針對(duì)AIM2基因最有效的沉默片段。
　　4.利用篩選出的針對(duì)AIM2基因的有效siRNA序列，干擾人腎小球系膜細(xì)胞。

4、將HMC細(xì)胞分為AIM2siRNA2＃及pcDNA3.0-1.1HBV共轉(zhuǎn)染組，AIM2siRNAcontrol及pcDNA3.0-1.1HBV共轉(zhuǎn)染組，AIM2siRNA2＃及pcDNA3.0共轉(zhuǎn)染組，熒光定量PCR與westernbolt分別檢測(cè)各組caspase-1，IL-1β，IL-18的表達(dá)。應(yīng)用SPSS17.0軟件分析caspase-1、IL-1β，IL-18在各組表達(dá)的差異。評(píng)價(jià)AIM2基因沉默后對(duì)這個(gè)炎性網(wǎng)絡(luò)中其他炎性因

5、子的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.人腎小球系膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)貼壁良好，顯微鏡下可見，HMC細(xì)胞均質(zhì)、透明，胞體呈纖維狀、梭形或長條形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不明顯，在生長時(shí)多呈放射狀，火焰狀等有規(guī)律的走行，符合成纖維細(xì)胞特征。
　　2.pcDNA3.0-1.1HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后隨即小量抽提質(zhì)粒，BamHI酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)目的基因定向插入成功。對(duì)pcDNA3.0-1.1HBV進(jìn)行測(cè)定和同源性分析，證實(shí)序列正確。
　　3

6、.FAM熒光標(biāo)記后測(cè)定轉(zhuǎn)染率在70％以上，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及生長均無明顯影響。熒光定量PCR及Westernblot結(jié)果顯示AIM2siRNA2＃相對(duì)基因抑制水平最強(qiáng)。
　　4.熒光定量PCR結(jié)果顯示與HBV組比較，阻斷AIM2表達(dá)可使caspase-1，IL-1β，IL-18表達(dá)量分別下降2.9、3.8、2.8倍。與AIM2siRNA組比較，轉(zhuǎn)染HBV可使caspase-1，IL-1β，IL-18表達(dá)量分別下降3.4、4.3、