miRNA-145-5p在真武湯干預(yù)腎小球腎炎免疫損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、慢性腎小球腎炎(Chronic glomerulonephritis，CGN)是由多種原因引起的免疫炎癥性疾病，其發(fā)病隱匿，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。近年來(lái)，miRNAs作為是一類內(nèi)源性、小分子非編碼RNA，廣泛參與各類腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展，有望進(jìn)一步解釋CGN發(fā)病的分子機(jī)制。白介素10（Interleukin-10，IL-10）是一種多細(xì)胞來(lái)源、功能多樣的炎癥與免疫抑制細(xì)胞因子，參與機(jī)體免疫炎性反應(yīng)。在腎臟中，IL-10由腎小

2、球系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞生成和分泌，參與調(diào)控正常腎生理功能，也在腎臟疾病中的細(xì)胞、分子間信號(hào)通路起著重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。越來(lái)越多研究證實(shí)，IL-10與miRNA之間存在直接或間接的相互影響作用，共同參與機(jī)體腎臟疾病過(guò)程中免疫應(yīng)答調(diào)控。中醫(yī)藥在慢性腎炎領(lǐng)域的預(yù)防和治療具有明顯的潛力和優(yōu)勢(shì)，真武湯作為溫陽(yáng)利水名方，臨床和實(shí)驗(yàn)都證實(shí)其對(duì)慢性腎炎療效確切，但慢性腎炎本身發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，隨著研究的深入，一些新的發(fā)病機(jī)制被不斷得到闡明;另外，由于中藥復(fù)方的作

3、用多靶點(diǎn)性，機(jī)制復(fù)雜，尚需不斷擴(kuò)展真武湯對(duì)慢性腎炎的藥理機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　1.制備陽(yáng)離子化小牛血清蛋白(C-BSA)所致CGN大鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用真武湯給藥治療干預(yù)，從尿蛋白量、腎功能、腎病理形態(tài)學(xué)改變、血清炎性因子含量和腎組織炎性因子的表達(dá)水平等指標(biāo)評(píng)價(jià)真武湯對(duì)CGN大鼠腎功能、病理和免疫炎癥的改善作用。
　　2.利用miRNA微陣列芯片篩選正常和CGN大鼠差異表達(dá)的miRNAs，并

4、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠性。在miRNA差異表達(dá)譜中找出在大鼠腎系膜細(xì)胞上有高表達(dá)的miRNA，預(yù)測(cè)其調(diào)控的靶基因，進(jìn)行下一步功能研究。
　　3.培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MC)，利用脂多糖(LPS)刺激誘導(dǎo)MC建立炎性增殖模型。利用真武湯含藥血清干預(yù)，考察真武湯含藥血清對(duì)MC的增殖、生長(zhǎng)周期和凋亡的影響，揭示真武湯對(duì)MC的增殖、凋亡的影響。
　　4.對(duì)MC轉(zhuǎn)染miR-145-5p的mimic和inhibitor，

5、檢測(cè)miR-145-5p和IL-10 mRNA的表達(dá)變化，揭示兩者之間的關(guān)系。同時(shí)研究IL-10介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的變化情況，在IL-10/AKT通路水平上進(jìn)行miR-145-5p功能研究。
　　方法:
　　1.取SD大鼠，腹腔注射C-BSA對(duì)大鼠預(yù)免疫兩周后，連續(xù)4周尾靜脈注射C-BSA誘導(dǎo)CGN大鼠動(dòng)物模型。自造模開(kāi)始第4周起，給予真武湯低、高劑量(4.2g/kg、8.4g/kg)，連續(xù)灌胃4周。以大鼠尿蛋白

6、、血肌酐、尿素氮和腎臟病理形態(tài)學(xué)等指標(biāo)評(píng)價(jià)真武湯對(duì)CGN大鼠腎功能的保護(hù)作用。以巨噬細(xì)胞侵染腎小球、血清中IL-10、 IL-1α和IL-2含量、腎組織中IL-10、TNF-α、IL-2和IL-6 mRNA的表達(dá)水平等指標(biāo)考察真武湯對(duì)CGN大鼠免疫炎癥的改善作用。
　　2.取正常組和CGN模型組大鼠腎組織各3例，經(jīng)miRNA標(biāo)記后，進(jìn)行miRNA芯片雜交。應(yīng)用GenePix Pro6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值，根據(jù)信

7、號(hào)值篩選兩組樣品間的差異表達(dá)miRNA。選取模型組上調(diào)表達(dá)的miR-145-5p和下調(diào)表達(dá)的miR-153-3p進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。
　　3.應(yīng)用脂多糖(LPS，10μ g/mL)刺激誘導(dǎo)MC炎性增殖模型，并用真武湯含藥血清進(jìn)行干預(yù)。應(yīng)用MTT和CCK8法測(cè)定真武湯對(duì)MC增殖的影響;PI染色后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定真武湯對(duì)ME周期的影響;AnexinⅤ/FITC測(cè)定各組MC凋亡情況。
　　4.對(duì)ME進(jìn)行miR-145-5p

8、mimic(50nM)、inhibitor(100nM)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后，應(yīng)用LPS(10μ g/mL)刺激MC炎癥反應(yīng)，并用真武湯含藥血清進(jìn)行干預(yù)。實(shí)時(shí)熒光定量PER檢測(cè)miR-145-5p、IL-10 mRNA的表達(dá)水平;蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化和p65、Cyclin D1總蛋白水平，評(píng)價(jià)miR-145-5p和真武湯對(duì)ME增殖的影響以及PI3K/AKT/GSK

9、信號(hào)通路和NF-KappaB的影響。
　　結(jié)果:
　　1.與模型組相比，真武湯可增加大鼠尿液排出、降低24h尿蛋白;降低血肌酐和尿素含量，保護(hù)腎功能;真武湯可以減輕腎小球炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小球肥大、腎小管上皮細(xì)胞的顆粒樣變性，抑制系膜基質(zhì)增殖，改善腎病理病變。真武湯可通過(guò)增加抗炎因子IL-10合成分泌，減少促炎因子IL-1α、IL-2、IL-6、TNF-α，抑制CGN大鼠的免疫炎癥反應(yīng)，繼而減輕腎臟免疫損傷。
　　2.比

10、較分析正常和CGN大鼠腎組織的miRNA差異表達(dá)譜，共篩選出差異表達(dá)miRA(fold change＞2.0)共有26個(gè)，其中模型組顯著上調(diào)miRNA有3個(gè)，23種miRNA表達(dá)下調(diào)，提示miRNA在CGN的發(fā)病與發(fā)展發(fā)揮著重要作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組腎組織miR-145-5p表達(dá)上調(diào)2.96倍，miR-153-3p下調(diào)2.65倍，與芯片結(jié)果趨勢(shì)一致，證明芯片結(jié)果可靠性高。
　　3.與LPS模型組比較

11、，真武湯可以明顯抑制MC的增殖，將MC有絲分裂抑制于G0期，但對(duì)MC的凋亡沒(méi)有明顯影響。
　　4.與模型組比較，miR-145-5p和真武湯都可以抑制LPS所致的MC增殖異常、促進(jìn)IL-10mRNA的表達(dá);還可以抑制AKT、GSK-3α、GSK-3β、p65蛋白的磷酸化，降低Cyclin D1總蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.真武湯可以通過(guò)增加CGN大鼠尿量、降低24h尿蛋白保護(hù)腎功能，減輕大鼠腎臟病理改變，抑制腎

12、小球免疫炎癥反應(yīng)，減輕免疫應(yīng)答損傷。
　　2.在CGN大鼠中有26個(gè)差異表達(dá)的miRNA參與CGN的發(fā)病與發(fā)展，其中miR-145-5p與真武湯在LPS刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥應(yīng)答中起重要調(diào)控作用相似，均可以上調(diào)IL-10的表達(dá)，通過(guò)抑制PI3K/AKT/GSK信號(hào)通路參與炎癥因子分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。
　　3.miR-145-5p和真武湯還可以通過(guò)降低Cyclin D1的表達(dá)，抑制MC的異常增殖;抑制NF-KappaB的活化，調(diào)控