不同培養(yǎng)方法和細(xì)胞因子對(duì)小鼠生精細(xì)胞的增殖分化效應(yīng).pdf

1、文章內(nèi)容分為兩部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分 不同培養(yǎng)方法對(duì)小鼠生精細(xì)胞的增殖分化效應(yīng)
　　目的:比較曲細(xì)精管片段培養(yǎng)和混合細(xì)胞共培養(yǎng)兩種不同方法對(duì)小鼠生精細(xì)胞的增殖分化效應(yīng),旨在建立一個(gè)高效、穩(wěn)定的小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,獲得更多接近成熟的單倍體精子細(xì)胞。方法:對(duì)7~8天齡小鼠生精細(xì)胞分別進(jìn)行曲細(xì)精管片段培養(yǎng)和混合細(xì)胞共培養(yǎng),通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、存活率和粗線期精母細(xì)胞特異性基因P19、單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1檢測(cè)及

2、染色體倍性分析,比較兩種培養(yǎng)方法生精細(xì)胞的存活、增殖以及分化情況。結(jié)果:曲細(xì)精管片段培養(yǎng)法第10~12天可見到圓形精子細(xì)胞,13~14天出現(xiàn)少量帶鞭毛的精子細(xì)胞或長(zhǎng)形精子,第10天可檢測(cè)出單倍體峰和單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1表達(dá);混合細(xì)胞培養(yǎng)法5~7天可見圓形精子細(xì)胞,第5天即可檢測(cè)出單倍體峰和單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1表達(dá),8~10天少量精子細(xì)胞長(zhǎng)出鞭毛或胞體漸變成長(zhǎng)形?；旌霞?xì)胞培養(yǎng)法所獲細(xì)胞數(shù)、存活率及單倍體精子細(xì)胞分化率均

3、顯著高于曲細(xì)精管片段培養(yǎng)法(P<0.05)。培養(yǎng)過程中,各級(jí)生精細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),存活率逐漸降低,細(xì)胞數(shù)減少,曲細(xì)精管片段培養(yǎng)和混合細(xì)胞培養(yǎng)分別在第3周和第4周出現(xiàn)大部分生精細(xì)胞和支持細(xì)胞脫落死亡。結(jié)論:曲細(xì)精管片段培養(yǎng)和生精細(xì)胞-支持細(xì)胞共培養(yǎng)均可獲得單倍體精子細(xì)胞,較之曲細(xì)精管片段培養(yǎng)法,混合細(xì)胞共培養(yǎng)法存活率更高,可更早獲得更多單倍體精子細(xì)胞。
　　第二部分 EGF和SCF對(duì)小鼠生精細(xì)胞的體外增殖分化效應(yīng)
　　目的:

4、通過在生精細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF),探討兩種細(xì)胞因子對(duì)生精細(xì)胞增殖、分化的最佳作用濃度以及它們之間的最佳組合濃度。方法:對(duì)7~8天齡小鼠生精細(xì)胞進(jìn)行混合細(xì)胞體外培養(yǎng),在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的EGF和SCF(分別為5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml),并進(jìn)行EG

5、F和SCF的交互實(shí)驗(yàn),通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、存活率和粗線期精母細(xì)胞特異性基因P19、單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1檢測(cè)及染色體倍性分析,探討EGF和SCF對(duì)生精細(xì)胞的體外增殖分化效應(yīng)。結(jié)果:加入 EGF或 SCF2-4天,各濃度組中可見不同程度增殖呈團(tuán)或鏈狀的細(xì)胞團(tuán)緊密連接,以EGF20ng/ml組和SCF40ng/ml組較為明顯,第5-7天出現(xiàn)圓形精子細(xì)胞,8-10天少部分精子細(xì)胞長(zhǎng)出鞭毛或漸變成長(zhǎng)形精子細(xì)胞,第4周出現(xiàn)大部分生精細(xì)胞和

6、支持細(xì)胞脫落死亡。培養(yǎng)第7天,EGF濃度為20ng/ml、SCF濃度為40ng/ml時(shí)生精細(xì)胞數(shù)和存活率顯著高于與其它各濃度組(P<0.05),且濃度為40ng/ml的SCF可顯著提高單倍體峰并降低P19/TP1比值(P<0.05)。EGF與SCF配伍時(shí),EGF濃度為12ng/ml時(shí)生精細(xì)胞增殖率最高,而SCF的作用效果呈線性遞增趨勢(shì)。結(jié)論:在混合生精細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中,添加一定濃度的EGF和SCF可顯著提高生精細(xì)胞數(shù)和存活率,而且SC