養(yǎng)殖青石斑魚(yú)（Epinephlus awoara）潰瘍病細(xì)菌病原及其DNA疫苗的研究.pdf

1、弧菌病是海水魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)中造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病，本論文致力于養(yǎng)殖石斑魚(yú)弧菌病病原菌及DNA免疫防治的研究，主要結(jié)果如下： 1、調(diào)查研究了2002年夏季廈門(mén)同安灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚(yú)大面積暴發(fā)的潰瘍病，對(duì)細(xì)菌病原進(jìn)行分離純化，編號(hào)為T(mén)S-628，回歸感染證實(shí)這株菌是引發(fā)同安灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖石斑魚(yú)潰瘍病的病原菌。采用生化鑒定的方法對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定，同時(shí)采用PCR技術(shù)獲得病原菌16SrRNA基因一段長(zhǎng)1121bp的序列，該序列登錄基因

2、庫(kù)(序列號(hào)為AY747308)。結(jié)合生化鑒定結(jié)果和16SrRNA基因同源性比較結(jié)果，確認(rèn)分離到的病原菌為哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)。 2、采用復(fù)性電泳技術(shù)，研究環(huán)境pH、溫度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病原菌TS-628胞外產(chǎn)物(ECP)蛋白酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胞外產(chǎn)物蛋白酶最適反應(yīng)pH在8.5左右，酸對(duì)ECP蛋白酶活性的抑制明顯強(qiáng)于堿對(duì)它的抑制作用；最適反應(yīng)溫度在20～50℃之間，20℃以下或50℃以上蛋白酶活性則受到明顯抑制

3、，表明蛋白質(zhì)酶不僅對(duì)高溫敏感，對(duì)低溫也很敏感；12h培養(yǎng)的胞外產(chǎn)物蛋白酶活性最強(qiáng)。最適溫度和pH條件下，主要出現(xiàn)3種蛋白酶，其中分子量為94kDa和分子量為26kDa的2種蛋白顯示了很強(qiáng)的蛋白酶活性，而且能在比較極端的溫度和pH值條件下保持活性，而分子量為35kDa蛋白酶只在最適反應(yīng)條件下出現(xiàn)，并且該蛋白酶的最適反應(yīng)條件與弧菌病暴發(fā)時(shí)的環(huán)境條件極為相似。 3、分別提取病原菌TS-628菌株的鞭毛蛋白、外膜蛋白(OMP)和脂多糖(

4、LPS)，應(yīng)用Westernblot技術(shù)分析檢測(cè)了這幾種主要表面抗原的抗原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白主要的免疫印跡帶約有6條，大致分子量分別為16kDa、20kDa、35kDa、38kDa、43kDa、52kDa，其中43kDa、52kDa免疫印跡反應(yīng)最強(qiáng)；OMP主要的免疫印跡帶約有7條，大致的分子量分別為16kDa、20kDa、35kDa、38kDa、43kDa、47kDa、52kDa，其中43kDa免疫印跡反應(yīng)最強(qiáng)。 4、采用PC

5、R的方法從哈維氏弧菌TS-628株基因組中，擴(kuò)增出鞭毛絲蛋白FlaA基因。將該基因克隆到T載體后測(cè)序，經(jīng)序列分析該基因全長(zhǎng)1140bp，編碼379個(gè)氨基酸，該基因編碼的多肽在N-、C-兩端的氨基酸序列更為保守，中間區(qū)域的變異較大，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)半胱氨酸，酪氨酸和組氨酸的含量也非常低，推測(cè)該蛋白質(zhì)的平均分子量為40.6kDa。BLAST程序檢索表明該基因與其他細(xì)菌鞭毛絲蛋白FlaA基因具有高度同源性，序列登錄基因庫(kù)，序列號(hào)為AY956422。

6、 5、將pcFlaA以肌肉注射方式免疫青石斑(E.awoara)，實(shí)驗(yàn)組注射重組質(zhì)粒pcFlaA，對(duì)照組Ⅰ注射空載體質(zhì)粒pcDNA3.1，對(duì)照組Ⅱ注射無(wú)菌生理鹽水。PCR技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，RT-PCR法在mRNA水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在魚(yú)肌肉中的表達(dá)，免疫組化染色技術(shù)在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)pcFlaA可以轉(zhuǎn)染魚(yú)類肌肉細(xì)胞并可在其中進(jìn)行表達(dá)，而且質(zhì)粒在魚(yú)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)的時(shí)間至少一個(gè)月。為檢測(cè)pcFlaA

7、質(zhì)粒免疫青石斑的免疫效果，免疫后第一周到第四周分別取樣品魚(yú)的頭腎淋巴細(xì)胞，在體外用抗原刺激，測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，結(jié)果對(duì)照組Ⅱ的刺激指數(shù)比較穩(wěn)定，而且明顯低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ⅰ，而實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Ⅰ的刺激指數(shù)有較大的波動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞增殖的平均SI值略微高于對(duì)照組Ⅰ，但并不明顯，表明經(jīng)pcFlaA和pcDNA3.1空載體免疫的青石斑淋巴細(xì)胞增殖能力都有所增強(qiáng)，但pcFlaA并未表現(xiàn)出明顯強(qiáng)于pcDNA3.1的免疫效應(yīng)，可能是pcDNA3