人源胸腺素α原和白介素2融合基因的真核表達(dá)及免疫保護(hù)效果初探.pdf

1、人源胸腺素α原(prothymosin α，proTα)是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和顯著的免疫刺激活性的酸性蛋白，主要用于治療腫瘤、肝炎、免疫系統(tǒng)等疾病。白介素2(interleukin 2，IL-2)是一種糖蛋白，它能增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，對(duì)腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、直腸癌有明顯療效，但過量使用IL-2 會(huì)帶來不良反應(yīng)。ProTα和IL-2 存在緊密的免疫刺激協(xié)同作用，proTα通過調(diào)節(jié)IL-2 誘導(dǎo)的NK 敏感細(xì)胞和LAK細(xì)胞毒性，使IL-

2、2的有效濃度降低一半。它們協(xié)同于自體瘤的效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用IL-2的效果。ProTα和IL-2 聯(lián)合使用不但能提高抗腫瘤的效果，還可降低單獨(dú)使用IL-2 產(chǎn)生的毒副作用。 本研究利用PCR技術(shù)從前期構(gòu)建好的pcDNA3.1-PTI 重組質(zhì)粒中克隆出proTα-linker-IL-2 融合基因，并對(duì)其進(jìn)行改造，在5′端加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的信號(hào)肽序列。將改造好的proTα-linker-IL-2 融合

3、基因(PI)克隆至真核載體pVAX中構(gòu)建成重組質(zhì)粒pVAX-PI，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過菌落PCR和酶切篩選陽(yáng)性單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示，改造后的融合基因序列與預(yù)期序列一致。 提取無內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pVAX-PI 并定量分析。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7中進(jìn)行表達(dá)，分別收集質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后24h、48h、72h、96h的細(xì)胞上清，用ELISA 法定量分析細(xì)胞上清中IL-2

4、蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，24h、48h、72h、96h轉(zhuǎn)染上清中的IL-2蛋白含量分別為5.4、7.8、6.1、5.7ug/L。采用CTLL-2 依賴細(xì)胞株測(cè)得轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h、96h細(xì)胞上清中的IL-2 活性分別為43、58、54、49IU/ml 。將小鼠原代脾細(xì)胞與細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清一起培養(yǎng)48h 后，MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染上清能刺激小鼠脾細(xì)胞增殖，表達(dá)的融合蛋白具有proTα的活性。最后，通過ECL western blo

5、tting 分析和鑒定了表達(dá)的融合蛋白的分子量約為31kDa。本次研究初步發(fā)現(xiàn)pVAX-PI 對(duì)小鼠黑色素瘤有一定的抑制作用，并且對(duì)荷瘤鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4 均有一定的誘生作用。pVAX-PI 質(zhì)粒免疫組的小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量隨時(shí)間的推移而逐漸上升。荷瘤小鼠接種pVAX-PI 質(zhì)粒后第5 周，ELISA定量分析小鼠外周血清中IFN-γ和IL-4的含量，肌肉注射聯(lián)合在體電脈沖刺激組分別為222pg/ml和