LTB-hpaA融合基因原核表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及其免疫保護(hù)作用.pdf

1、幽門螺桿菌是微需氧的革蘭陰性桿菌，呈螺旋狀。多數(shù)國(guó)家和地區(qū)Hp感染率高達(dá)50％以上，許多感染者都是無癥狀的，但是有部分感染者可出現(xiàn)急慢性胃炎和消化性潰瘍，Hp的持續(xù)性感染還與胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前關(guān)于Hp疫苗的研究較少。 Hp粘附素是細(xì)菌鞭毛鞘膜蛋白，也是細(xì)菌主要的粘附因子之一。hpaA基因位于細(xì)菌基因組DNA上，其核苷酸或氨基酸序列高度保守，并且有研究發(fā)現(xiàn)在大約86％的Hp患者血清中可檢測(cè)到HpaA抗體，因此可作

2、為Hp基因工程疫苗的侯選抗原。 基因工程疫苗多以單一蛋白作為抗原，其免疫效果常不盡人意，通常需要使用佐劑來提高此類疫苗的免疫效果，有文獻(xiàn)報(bào)道LTB粘膜免疫佐劑活性明顯高于CTB，因此LTB作為疫苗佐劑更為合適。 材料方法： 1.菌株來源及培養(yǎng) 將本室保存的HpY06、SS1(sydneystrain1)菌株涂布于Hp選擇性平板培養(yǎng)基上，微需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)5d，凡能在Hp選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)、針尖樣透明菌落

3、、革蘭陰性細(xì)小彎曲桿菌、快速尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性、能與Hp全菌抗體發(fā)生凝集者鑒定為Hp。 大腸桿菌44815株購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。將大腸桿菌44815株接種于LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，若是革蘭陰性、中等大小桿菌者，再次轉(zhuǎn)種培養(yǎng)。 2.細(xì)菌基因組DNA的制備 采用常規(guī)的苯酚—氯仿法提取HpY06株和大腸桿菌44815株培養(yǎng)物的基因組DNA，經(jīng)無DNA酶的RNA

4、酶消化后，再用苯酚—氯仿法將提取的DNA溶于TE緩沖液中作為PCR的模板，用分光光度法測(cè)定DNA的濃度和純度。 3.hpaA基因和ltB基因的擴(kuò)增 根據(jù)報(bào)道的hpaA和ltB的基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR擴(kuò)增hpaA和ltB全基因序列，溴乙錠染色的1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。 4.hpaA和ltB基因T-A克隆和核苷酸序列測(cè)定 采用上海申能博彩生物科技有限公司(SNBC)的3SPCRProduct

5、PurificationKitV2.0回收目的擴(kuò)增片段。目的擴(kuò)增片段連接于pUCm-T載體中，形成用于測(cè)序的pUCm-T-hpaA、pUCm-T-ltB重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，經(jīng)藍(lán)白篩選的陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后用堿變性法提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定后用雙脫氧鏈末端終止法測(cè)定插入片段的核苷酸序列。所獲得的序列與GeneBank登錄的hpaA基因和ltB基因序列進(jìn)行核苷酸同源性比較。 5.ltB-hpaA融合基因的構(gòu)建

6、擴(kuò)增含pUCm-T-ltB和pUCm-T-hpaA的E.coliDH5α，堿變性法提取質(zhì)粒，經(jīng)無DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚-氯仿法提取質(zhì)粒。以pUCm-T-ltB質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增ltB全基因片段，ltB上游引物序列：5'-CCGGGATCCTGAATAAAGTAAATGTTA-3’(BamHⅠ)下游連接引物序列：5，-CTTTAAAATGATTATTTGCTCTGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3’，反應(yīng)條件同上

7、，采用凝膠回收試劑盒(BBST)回收目的片段。pUCm-T-hpaA質(zhì)粒用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切2h，回收目的片段，紫外分光光度法測(cè)定其濃度。以總含量100ng、ltB∶hpaA≈2∶1兩種DNA回收片段為模板，反應(yīng)總體積為90μl，內(nèi)含除引物外的PCR各試劑，反應(yīng)參數(shù)：94℃5min，×1；94℃30sec，45℃30sec，72℃150sec，×10；72℃10min，×1，以便形成復(fù)合模板。然后加入濃度均為250nmo

8、l/L的上述ltB上游引物和hpaA下游引物5'-CCGAAGCTTTCGGTTTCTCTTGTTTTTC-3’(HindⅢ)，反應(yīng)參數(shù)：94℃3min，×1；94℃30S，50℃30S，72℃90S，×10；94℃30S，50℃30S，72℃180S(以后每循環(huán)增加15S)，×15；72℃10min，×1。1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，目的擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小為1177bp。 6.ltB-hpaA融合基因T-A克隆、亞克

9、隆和核苷酸序列測(cè)定 按上法將ltB-hpaA片段克隆、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、提取質(zhì)粒。測(cè)序?qū)Ρ刃蛄泻螅瑢⒅亟M質(zhì)粒及pQE32雙酶切后獲得的目的片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化于E.coliM15，獲得工程菌pQE32-ltB-hpaA-M15。然后擴(kuò)增、提取質(zhì)粒后再次測(cè)序。 7.目的重組蛋白表達(dá)和純化 重組表達(dá)系統(tǒng)pQE32-ltB-hpaA-M15分別在含1.0、0.5和0.1mmol/LIPTG的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，其中1.

10、0mmol/LIPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎、5000r/min離心5min后分為上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢查重組蛋白(rLTB-HpaA)的分子量、表達(dá)產(chǎn)量和存在形式。采用Ni-NTA親和層析法提純上述重組蛋白。 8.rLTB-hpaA免疫原性、免疫反應(yīng)性和佐劑活性的鑒定 以兔抗Hp全菌抗體為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，用westernbolt檢測(cè)rLTB-HpaA的免疫反應(yīng)性。NTA親和層析法(BBS

11、T)收集的rLTB-HpaA免疫家兔，用westernbolt檢測(cè)rLTB-HpaA的抗原性。 用牛GM1(Sigma)包被酶標(biāo)板，洗滌后分別加入每孔4μg的rLTB-HpaA，重復(fù)4孔。以兔抗rLTB-HpaA血清為一抗、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗、OPT為底物，顯色后檢測(cè)OD490吸光值。實(shí)驗(yàn)中以等量BSA代替rLTB-HpaA作為陰性對(duì)照。以陰性對(duì)照平均吸光值+3SD為陽(yáng)性。 9.小鼠保護(hù)試驗(yàn) 將BALB

12、/c小鼠分組，每組12只。各組分別命名為實(shí)驗(yàn)組(rHpaA)、實(shí)驗(yàn)組(rLTB-HpaA)、感染對(duì)照組和正常對(duì)照組。將rHpaA和rLTB-HpaA分別溶于pH7.4、0.01mol/LPBS中。各試驗(yàn)組小鼠分別用rHpaA、rLTB-HpaA進(jìn)行口服(灌喂)免疫，末次免疫后第28、30、32d三次灌喂5×1010CFU/ml的HpSS1株懸液200μl。末次感染4周后處死各組小鼠，取胃竇組織標(biāo)本勻漿后接種于選擇性哥倫比亞血瓊脂平板，微

13、需氧條件下37℃培養(yǎng)5-7d，Hp鑒定方法同前。10.ELISA 用濃度為20μg/mlrLTB-HpaA融合蛋白包被酶標(biāo)板，分別以1∶200稀釋的患者血清為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗、鄰苯二胺為底物，用ELISA來檢測(cè)126例Hp感染者血清中HpaA抗體存在情況。顯色后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490nm的吸光值，超過6份陰性血清平均吸光值+3SD者為陽(yáng)性。 結(jié)果1.PCR ltB、hpaA、ltB-hpa

14、A的PCR擴(kuò)增片段的大小分別約為375bp、802bp和1177bp。 2.核苷酸和氨基酸序列分析 與GenBank登錄的基因序列比較，所克隆的hpaA和ltB核苷酸序列相似性分別為94.25％～97.32％和99.12％～99.71％，氨基酸序列相似性為95.38％～98.46％和97.58％～99.19％。ltB-hpaA融合基因序列與ltB、hpaA基因序列完全相同。 3.表達(dá)載體的鑒定 pQE32

15、-ltB-hpaA經(jīng)雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳后，在預(yù)期位置上可見目的條帶；核苷酸序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)了插入的目的基因序列和方向正確。 4.目的：蛋白的表達(dá) SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG能較好地誘導(dǎo)目的蛋白rLTB-HpaA的表達(dá)，產(chǎn)量約占全菌蛋白的30％，但主要以包涵體形式存在。 5.rLTB-hpaA的免疫原性、免疫反應(yīng)性和佐劑活性。 Westernbolt證實(shí)：兔抗Hp全菌抗體和NTA親和層析法收集的

16、rLTB-HpaA免疫家兔后產(chǎn)生的抗體均能與rLTB-HpaA結(jié)合。 anti-rLTB-HpaA血清1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋度時(shí)，rLTB-HpaA陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)值分別為0.68、0.52、0.55和0.19，rLTB-HpaA試驗(yàn)組OD490值分別為1.64、1.55、1.52、1.10，表明rLTB-HpaA能與牛GM1結(jié)合。 6.小鼠保護(hù)試驗(yàn) rHpaA免疫小鼠的保護(hù)率僅為66.7％，而r

17、LTB-HpaA免疫小鼠的保護(hù)率可增至83.3％。 7.ELISA結(jié)果 6例陰性血清的OD490均值±SD為0.11±0.03，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為0.20；81.6％患者血清(102/125)HpaA抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，其OD490值范圍0.54～1.84。 6例細(xì)菌陰性對(duì)照的OD490均值±SD為0.04±0.04，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為0.16；41株Hp的HpaA檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性，其OD490值范圍0.52～1.47。 結(jié)