膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特異性癌基因篩選以及癌基因FoxM1通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGF表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)及血管生成的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中楸神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，WHOIII，IV級(jí)膠質(zhì)瘤(間變性星形細(xì)胞瘤以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)具有高度侵襲性，術(shù)后復(fù)發(fā)快，并對(duì)放療和化療表現(xiàn)出內(nèi)在抗性，患者預(yù)后不佳。盡管如此針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療包括擴(kuò)大性根治切除并輔助放療及化療等多種方式，患者一年期累積生存率仍小于30％，僅有3％的患者生存期超過5年，總平均生存時(shí)間6-9個(gè)月。多年來，針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方式不斷改進(jìn)，但卻未能改進(jìn)該病的總體預(yù)后，因此尋找和發(fā)現(xiàn)治療惡性膠質(zhì)

2、瘤更加有效的新方法已成為神經(jīng)腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。闡明惡性膠質(zhì)瘤的致病分子通路及其對(duì)抗放化療的分子基礎(chǔ)，是尋找和確認(rèn)有效的治療靶點(diǎn)、發(fā)展合理的新綜合治療策略的關(guān)鍵。
　　 基因表達(dá)芯片是今年來新興的一項(xiàng)研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的技術(shù)。利用基因表達(dá)芯片技術(shù)，通過比對(duì)惡性膠質(zhì)瘤患者的腫瘤樣品總mRNA以及非腫瘤患者的腦組織樣本總mRNA，我們希望篩選出惡性膠質(zhì)瘤患者特異性表達(dá)的癌基因標(biāo)志物，并研究其導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，

3、希望發(fā)現(xiàn)將來治療的新靶點(diǎn)。通過基因芯片，我們篩選出一系列在惡性膠質(zhì)瘤中特異性高表達(dá)的癌基因，包括AEG-1(Astrocyte Elevate Gene-1)，SPHK1( Sphingosine Kinase-1)，F(xiàn)oxM1(Forkhead Transcription Factor M1)，VEGF(vascular endothelialgrowth factor)等。在大樣本的乳腺癌標(biāo)本以及惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)，AEG-

4、1,SPHK1,FoxM1等癌基因表達(dá)水平和腫瘤分級(jí)，患者生存期呈高度負(fù)相關(guān)，可作為新的檢測(cè)腫瘤發(fā)生的早期標(biāo)志物以及作為腫瘤患者預(yù)后判定的標(biāo)志物。同時(shí)，我們深入研究了FoxM1通過調(diào)控VEGF基因?qū)е聬盒阅z質(zhì)瘤發(fā)生中的具體分子機(jī)制。
　　 新生血管和缺氧性酸中毒是包括惡性膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實(shí)體性腫瘤形成的標(biāo)志性指標(biāo)。vascular endothelialgrowth factor(VEGF)是最重要的導(dǎo)致新生血管形成的生長(zhǎng)因子之一。

5、作為血管通透性和新生血管早期誘導(dǎo)因子，VEGF在惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)極高并對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的快速生長(zhǎng)和浸潤起到重要的作用。目前認(rèn)為，缺氧和酸中毒均為誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)的重要因素，包括通過HIF-1(hypoxia inducefactor-1)等導(dǎo)致的VEGF高表達(dá)；同時(shí)VEGF表達(dá)也受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，例如STAT3(signal transducer and activator of transcription3)等。研究表明，HI

6、F-1在腫瘤內(nèi)部缺氧的環(huán)境下表達(dá)增高，并直接作用于VEGF基因的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)VEGF基因mRNA表達(dá)。然而，在惡性膠質(zhì)瘤中，VEGF增高也常見于腫瘤浸潤正常組織的邊緣，而這些邊緣部位并無十分明顯的缺氧環(huán)境。與此同時(shí)，在某些含氧量趨于正常的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中也可以檢測(cè)到過量表達(dá)的VEGF。此外，STAT3誘導(dǎo)VEGF表達(dá)也頗具爭(zhēng)議，目前的公認(rèn)意見傾向于STAT3對(duì)VEGF的作用決定于腫瘤本身的遺傳背景。例如報(bào)道指出，在某些惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系

7、中，STAT3的表達(dá)可以促進(jìn)體外腫瘤的存活，而其他的報(bào)道則指出在STAT3另一些惡性膠質(zhì)瘤中則基本無表達(dá)。在VEGF對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用十分明確的前提下，研究其他導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤中VEGF增高的原因顯得十分必要。
　　 FoxM1(Forkhead Transcription Factor M1)屬于Fork Head(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞周期G2/M期調(diào)控有重要作用。FoxM1在細(xì)胞進(jìn)入G2期時(shí)表達(dá)量急劇增加，在細(xì)胞進(jìn)入M

8、期后立即降解，對(duì)保持細(xì)胞分裂過程的順利進(jìn)行起著精確的調(diào)控作用。FoxM1的異常表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞分裂加速.生長(zhǎng)失去控制而引起腫瘤發(fā)生。前期報(bào)道顯示，在多種實(shí)體性惡性腫瘤，包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，肺癌和大腸癌等中FoxM1均有不同程度的高表達(dá)。最近，兩則獨(dú)立研究報(bào)道顯示FoxM1在惡性膠質(zhì)瘤中也有明顯的增加。Dr.Huang實(shí)驗(yàn)室的研究表明，F(xiàn)oxM1是膠質(zhì)瘤中主要表達(dá)的FoxM1蛋白，并且FoxM1在正常腦組織中未見表達(dá)。此外，F(xiàn)ox

9、M1的表達(dá)和惡性膠質(zhì)瘤的分級(jí)高度正相關(guān)，并且和患者的生存期高度負(fù)相關(guān)。在動(dòng)物模型中，增加FoxM1的表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的致瘤性和侵襲性增加。在間變性星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)FoxM1,可以在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)形成高度惡性并伴高度新生血管生成的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。這提示我們FoxM1對(duì)腫瘤的血管生成起著重要的作用。
　　 本課題研究中，我們提取了60例惡性膠質(zhì)瘤患者的手術(shù)腫瘤標(biāo)本總mRNA以及20例非腫瘤患者的手術(shù)標(biāo)本總mRNA，利用基因表達(dá)芯

10、片技術(shù)，我們分析了腫瘤患者和非腫瘤患者間的mRNA表達(dá)差異，篩選出一系列的在惡性膠質(zhì)瘤中高特異性高表達(dá)的癌基因。在這些癌基因中，我們選擇了AEG-1,SPHK1以及FoxM1進(jìn)行研究。通過大樣本的乳腺癌標(biāo)本(225例)的免疫組化染色證明，AEG-1在腫瘤中高表達(dá)，并且和腫瘤的分級(jí)以及患者預(yù)后高度負(fù)相關(guān)。在大樣本的膠質(zhì)瘤標(biāo)本(243例)中的免疫組化染色證實(shí)，SPHK1也和腫瘤分級(jí)以及預(yù)后高度負(fù)相關(guān)。接下來，我們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞系和乳腺癌細(xì)胞系

11、中的研究發(fā)現(xiàn)，AEG-1和SPHK1在蛋白水平和mRNA水平與正常細(xì)胞相比呈高表達(dá)，并且在患者樣本中證實(shí)了以上結(jié)果。通過我們的研究表明，AEG-1和SPHK1均可以作為腫瘤發(fā)生的早期診斷指標(biāo)，并可以作為預(yù)期的治療靶點(diǎn)。
　　 FoxM1作為另外一個(gè)篩選出的癌基因，已有研究表明其在惡性膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并與患者預(yù)后以及生存期高度負(fù)相關(guān)。為了研究FoxM1和VEGF在導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生的具體機(jī)制，我們闡明FoxM1以及VEGF在人腦膠

12、質(zhì)瘤中的表達(dá)狀況，從而了解FoxM1,VEGF與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的相關(guān)性；繼而闡明FoxM1調(diào)節(jié)VEGF的具體分子機(jī)制，最后在動(dòng)物模型中驗(yàn)證FoxM1調(diào)節(jié)VEGF導(dǎo)致腫瘤形成。我們首先比較FoM1和VEGF在低級(jí)別膠質(zhì)瘤，間變性星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者標(biāo)本中的表達(dá)，F(xiàn)oxM1表達(dá)和VEGF表達(dá)呈高度正相關(guān)。利用免疫組化檢測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤石蠟包埋切片59例，我們發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)不僅局限于腫瘤中心缺氧部位，并且在腫瘤浸潤邊緣也十分明顯。

13、然而，在擴(kuò)大切除標(biāo)本中相對(duì)“正?！钡哪X組織中并無VEGF表達(dá)。統(tǒng)計(jì)表明，F(xiàn)oxM1表達(dá)和VEGF表達(dá)程度高度相關(guān)(r=0.79，p<0.001)。類似的相關(guān)性結(jié)果也在間變性星形細(xì)胞瘤中觀察到(r=0.75，p<0.001)。同時(shí)在冰凍切片中通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)FoxM1表達(dá)高的細(xì)胞，包漿以及周圍表達(dá)VEGF含量也相應(yīng)增高。不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本蛋白水平顯示，F(xiàn)oxM1表達(dá)水平和VEGF表達(dá)水平高度相關(guān)。為了闡明FoxM1調(diào)節(jié)

14、VEGF的分子機(jī)制，我們建立了FoxM1穩(wěn)定過表達(dá)的兩株間變性星形細(xì)胞瘤細(xì)胞株SW1783-FoxM1以及HS683-FoxM1,同時(shí)建立了兩株FoxM1穩(wěn)定沉默的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87-FoxM1shRNA以及U251-FoxM1shRNA，在體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)FoxM1可以在SW1783和HS683細(xì)胞水平增加VEGFmRNA和蛋白水平的表達(dá)，而通過RNAi沉默F(xiàn)oxM1則降低了U87和U251細(xì)胞株中VEGFmRNA和蛋白水

15、平的表達(dá)。為了研究FoxM1調(diào)控VEGF表達(dá)的機(jī)制，我們克隆了VEGF的啟動(dòng)子，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證明了FoxM1可以直接激活VEGF的啟動(dòng)子。進(jìn)而，我們通過點(diǎn)突變技術(shù)改變了VEGF啟動(dòng)子上FoxM1結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)的序列，發(fā)現(xiàn)FoxM1無法激活突變的VEGF啟動(dòng)子。從而證明了FoxM1的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于VEGF的激活具有關(guān)鍵性的作用。同時(shí)我們運(yùn)用了CHIP技術(shù)，在細(xì)胞內(nèi)證實(shí)了FoxM1結(jié)合到VEGF啟動(dòng)子區(qū)域的特異性結(jié)合位點(diǎn)。為了證明F

16、oxM1和VEGF啟動(dòng)子的直接結(jié)合，我們采用EMSA技術(shù)，使用磷32放射性標(biāo)記證明FoxM1在體外可以和VEGF啟動(dòng)子上特異性的FoxM1識(shí)別位點(diǎn)完全結(jié)合。Super Shfit試驗(yàn)表明，F(xiàn)oxM1和VEGF啟動(dòng)子的結(jié)合具有特異性。最后，為了在體內(nèi)試驗(yàn)證明FoxM1調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，我們?cè)诼闶笤囼?yàn)中采用原位注射的方式，直接誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤。在動(dòng)物模型試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，U251和U87細(xì)胞原位注射誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生膠質(zhì)瘤的成功率為100％，(5