應用多重PCR技術和基因芯片技術區(qū)分偽狂犬病病毒強弱毒和胸膜肺炎放線桿菌血清型2菌株莢膜多糖的初步研究.pdf

1、本研究包括三個部分。1.偽狂犬病病毒多重PCR檢測方法的建立偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由a皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種嚴重傳染病。豬是該病毒的天然宿主和貯存者。該病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。預防、控制和最終根除該病是我國當前面臨的一項艱巨任務。 本研究根據(jù)基因庫中的豬偽狂犬病病毒(PrV)各基因的序列，設計了與PrV的gB、

2、gD、gE基因序列互補的3對引物。對樣品中的PrVDNA模板進行了多重PCR擴增及反應條件的優(yōu)化，結果同時得到與設計相符合的3條特異性條帶，分別為549bp(gB)、429bp(gD)、366bp(gE)。用這3對引物對TK-/gI-/gE-三基因缺失疫苗毒的樣品DNA模板進行多次多重PCR擴增，均能穩(wěn)定得到與設計相符合的2條特異性條帶。敏感性試驗結果表明，多重PCR可以檢測到106pg三基因缺失疫苗毒或756pgPrV野毒的核酸模板量

3、。特異性試驗結果表明，以正常對照細胞及豬圓環(huán)病毒和豬細小病毒DNA為模板進行多重PCR擴增，均無任何條帶。 2.基因芯片技術檢測PrV的研究選取了豬偽狂犬病病毒(PrV)gD，gB，gE基因(gE-，gE)、藍耳病病毒(PPRSV)ORF6、圓環(huán)病毒Ⅱ(PCV2)ORF2、細小病毒(PPV)NS1、乙型腦炎病毒(JEV)NS1的保守片段(200-300bp)和作為內(nèi)參的豬源看家基因GAPDH部分片段(250bp)、人β-acti

4、n等片段作為捕獲探針并設計了特異性引物，固定在芯片上，制成芯片；編碼PrV野毒株和gE-突變株保守性糖蛋白的gD，gB，gE基因，通過多重PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)過純化、標記、變性后雜交到制備的芯片上，結果表明PrV野毒株和gE-突變株gD，gB均出現(xiàn)陽性雜交信號，然而，在gE基因缺失的部位(gF)，PrV野毒株出現(xiàn)陽性雜交信號，gE-突變株不出現(xiàn)雜交信號。PrVPCR產(chǎn)物和PRRSV，JEV，PCV2，PPV的捕獲探針間無非特異性雜交信號。

5、芯片能夠最低檢測出3.24fg的DNA模板，其敏感性至少比普通gD-PCR高10倍。本研究說明基因芯片技術能檢測偽狂犬病病毒并鑒別野毒與gE-突變株感染。 3.胸膜肺炎放線桿菌莢膜多糖基因的克隆表達豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(ActinobacillusPleuropneumoniae，App)引起的一種具有高度傳染性的呼吸道疾病，是危害當前世界各國養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。豬胸膜肺炎放線桿

6、菌莢膜多糖是該菌的毒力相關因子，且莢膜多糖的血清型差異及合成的數(shù)量決定了菌毒力大小。本實驗參考豬胸膜肺炎放線桿菌血清型2型莢膜多糖的基因序列(GenbankAY357726)分別設計了三對特異性引物，通過PCR擴增，獲得了長度分別為1137bp、429bp、1146bp的CpsA、CpsB、CpsC三個基因片段，然后將其分別克隆到PMD18-T中，經(jīng)酶切鑒定和序列分析獲得了陽性克隆子，再將CpsA、CpsB、CpsC分別插入到原核表達載