胞膜主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥機(jī)制的研究及分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染重要的條件致病菌，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染在醫(yī)院中的大規(guī)模流行時(shí)有報(bào)導(dǎo)。2006-2008年本院臨床微生物監(jiān)測(cè)顯示的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥譜十分相似。為了進(jìn)一步明確2006-2008年我院出現(xiàn)的多重耐藥菌株的同源性及是否存在克隆傳播，本研究采用微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用腸桿菌科基因問重復(fù)序列引物PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensusseq

2、uence-based PCR，ERIC-PCR)技術(shù)對(duì)從患者體內(nèi)分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，并探討鮑曼不動(dòng)桿菌的胞膜主動(dòng)外排泵機(jī)制，分析其基因表型及耐藥性傳播機(jī)制，闡明其分子流行病學(xué)特征與主動(dòng)外排泵耐藥系統(tǒng)的關(guān)系；為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，監(jiān)測(cè)和控制耐藥菌株的播散提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為三個(gè)部分：
　　 ㈠多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排表型的檢測(cè)及其主動(dòng)外排泵編碼基因分析。
　　 方法：標(biāo)本為2006

3、-2008年來源于我院患者體內(nèi)分離后留有菌種的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共23株，其中2006年8株，2007年3株，2008年12株；1株為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參考菌株ATCC27853。菌種鑒定采用Vitek32系統(tǒng)。采用瓊脂二倍法測(cè)定外排泵抑制劑(奧美拉唑、利血平和氰氯苯腙)對(duì)抗菌藥物對(duì)抗多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌活性的影響，以加入泵抑制劑后抗生素MIC下降≥4倍為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，提示存在主動(dòng)外排機(jī)制，并應(yīng)用PCR和DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步了解主動(dòng)外排泵的編碼基因。<

4、br>　　 結(jié)果：外排泵抑制劑奧美拉唑、利血平、氰氯苯腙(CCCP)三者均對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵有抑制作用，但抑制強(qiáng)度不一，以CCCP作用最強(qiáng)，而奧美拉唑作用最弱。加入CCCP篩選出鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵的陽(yáng)性株為16株，陽(yáng)性率為69.6％，而利血平和奧美拉唑分別篩選出4、2株，陽(yáng)性率僅為17.4％、8.7％。以AdeB為引物經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增主動(dòng)外排泵編碼基因，PCR檢測(cè)結(jié)果為16株陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序分析后，證實(shí)為AdeB主動(dòng)外排泵編碼基因，其中

5、11株同樣為CCCP篩選出的陽(yáng)性菌株。
　　 結(jié)論：從2006-2008年本院住院患者體內(nèi)分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制存在主動(dòng)外排系統(tǒng)的參與，其基因型主要為AdeB型。CCCP、利血平和奧美拉唑均對(duì)主動(dòng)外排泵有抑制作用，但CCCP更適合作為篩選鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵的抑制劑。
　　 ㈡多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵表達(dá)量的檢測(cè)。
　　 方法：標(biāo)本為第一部分所調(diào)查的PCR檢測(cè)主動(dòng)外排泵編碼基因陽(yáng)性的菌株，共

6、16株。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)主動(dòng)外排泵adeB及adeRS基因的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：PCR檢測(cè)陽(yáng)性的菌株中有14株RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即有adeRS、adeB的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，呈現(xiàn)為a、b、d、g和i共5種耐藥模式；編號(hào)2535號(hào)及編號(hào)2631號(hào)菌株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，但CCCP檢測(cè)結(jié)果為2535號(hào)菌株為陰性，2631號(hào)CCCP檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；編號(hào)519、2884、8865和13140號(hào)菌株

7、PCR和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，但CCCP檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
　　 結(jié)論：本次研究所調(diào)查的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的主動(dòng)外排泵表達(dá)程度不盡相同，說明CCCP作為篩選鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵的抑制劑時(shí)不一定能全部反應(yīng)細(xì)菌外排泵情況。
　　 ㈢ERIC2-PCR分析多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的同源性。
　　 方法：標(biāo)本為第一部分所調(diào)查2006-2008年來源于我院患者體內(nèi)分離后留有菌種的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共23株，菌種鑒定采

8、用Vitek32系統(tǒng)。分子流行病學(xué)分型采用ERIC-PCR分型?；蚪M指紋圖譜結(jié)果用BioNumerics4.6I軟件分析，凡相似度的值大于80％者被歸為一克隆株。
　　 結(jié)果：23株鮑曼不動(dòng)桿菌可劃分為7種基因型，分別描述為A、B、…F、G型，以A型最多，有12株，占52.2％，且可分為2個(gè)亞型A1和A2，其中A1亞型有5株，主要分布在內(nèi)科系統(tǒng)，標(biāo)本來源以痰為主，在06、08年檢出；A2亞型有7株，主要分布在外科系統(tǒng)及重癥監(jiān)護(hù)