豬囊尾蚴cYI基因重組子的建立及表達(dá).pdf

1、目的：本研究采用基因重組技術(shù)，構(gòu)建豬囊尾蚴cYI基因原核表達(dá)載體，觀察其在大腸桿菌中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究cYI基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，從而為開發(fā)囊蟲病特異性診斷抗原和基因疫苗提供理論依據(jù)。 方法： 1.目的基因的獲得：以本室保存的豬囊尾蚴進(jìn)行RNA的提取，根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR，條件為：37℃50min，94℃預(yù)變性5min，按94℃1min，56℃1min，72℃1min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72

2、℃延伸10min，4℃保存?zhèn)溆谩?2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DE3：RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化，用NdeI及XhoI末端修飾后與經(jīng)相同酶消化、回收的原核高效表達(dá)載體pET28b進(jìn)行體外定向重組，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DE3，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選白色單一菌落，按堿裂解法提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切，鑒定是否含有插入片段。 3.重組表達(dá)：將含有目的基因的陽(yáng)性菌于37℃活化后轉(zhuǎn)種到L

3、B(含卡那)液體培養(yǎng)基中。次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)種到LB(含卡那)液體培養(yǎng)基中繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，分別于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后1h、2h、3h、4h取菌液1ml，離心，收集菌體并用TEBuffer懸浮。 4.表達(dá)產(chǎn)物的蛋白電泳(SDS-PAGE)：將陰性對(duì)照產(chǎn)物及誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后1h、2h、3h、4h的表達(dá)產(chǎn)物pET28b-cYI離心收集菌體，置混旋器上振蕩重懸，然后超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀，取少量收集到的上清及

4、沉淀分別加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液混勻后煮沸5min，冰浴2-3min。再進(jìn)行10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，并以蛋白質(zhì)低分子量maker作為標(biāo)準(zhǔn)。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色和脫色。將脫色后的凝膠照相。 5.重組蛋白的大量獲得：將含有pET28b-cYI的重組菌活化后，于37℃，表達(dá)4h，離心收集菌體，超聲破碎后溶于適量TE中再經(jīng)濾器過慮除菌、純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260定量，-20℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果

5、：根據(jù)已知DNA序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后鑒定DNA片段的大小，紫外燈下可見一條約500bp的特異條帶，與預(yù)期大小相吻合。將該片段與表達(dá)載體pET28b分別經(jīng)雙酶切后體外重組轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)抗生素(卡那霉素)篩選后獲得含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeI及XhoI消化，插入的cYI片段可被消化切下，其片段長(zhǎng)度符合預(yù)期設(shè)計(jì)。將上述陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎，離心后分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAG

6、E電泳，結(jié)果表明該融合蛋白主要以包涵體形式存在于細(xì)菌裂解物的上清中，同時(shí)設(shè)置空載體表達(dá)產(chǎn)物對(duì)照，并參照分子量標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，未插入目的基因的pET28b/DE3無特異性蛋白表達(dá)，而插入目的基因的pET28b-cYI/DE3表達(dá)特異性蛋白，分子量約為18KD，與預(yù)期大小相符。同時(shí)經(jīng)凝膠圖像系統(tǒng)分析，該蛋白表達(dá)量約占菌體蛋白總量的30％。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)成功獲得了豬囊尾蚴cYI基因； 2.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了cYI的