一個(gè)新的豬囊尾蚴蛋白的cDNA分子篩選、克隆、表達(dá)與鑒定.pdf

1、目的:應(yīng)用免疫學(xué)方法篩選豬囊尾蚴cDNA文庫(kù)，以尋找新的編碼豬囊尾蚴病診斷抗原候選分子基因。 方法：采集豬囊尾蚴患者血清，用大腸桿菌裂解液吸附去除其中的大腸桿菌抗體；免疫學(xué)篩選豬囊尾蚴cDNA文庫(kù);在2次復(fù)篩陽(yáng)性的克隆中選取9個(gè)進(jìn)行插入片斷的核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果送GenBank進(jìn)行同源性分析。根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，選取其中四個(gè)其完整開(kāi)放閱讀框架的基因，設(shè)計(jì)合成引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將其克隆入PMD-18T載體，然后再亞克隆至原核表

2、達(dá)載體PET28a(＋)中。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定。 結(jié)果：用抗血清初篩了約6.1×103個(gè)重組噬菌體，得到42個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其中的18個(gè)克隆進(jìn)行復(fù)篩，得到9個(gè)持續(xù)陽(yáng)性反應(yīng)克隆。選取其中有插入片段的4個(gè)重組噬菌體單克隆進(jìn)行序列測(cè)定，獲得的序列經(jīng)GenBank進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn)4條序列均為未知的豬囊尾蚴序列，其中編號(hào)為5H克隆的插入序列與編碼日本血吸蟲(chóng)核糖體樣蛋白的基因具高度同

3、源性，其具有一個(gè)528bp的完整開(kāi)放閱讀框。PCR法擴(kuò)增該基因，克隆入載體PMD-18T，再亞克隆入原核表達(dá)載體PET28a中，所形成的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可獲得一條與PCR產(chǎn)物一致的DNA片段。IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)彳亍SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在約24KDa位置出現(xiàn)一條表達(dá)條帶，且隨著表達(dá)時(shí)間的推移，表達(dá)產(chǎn)物量增大。Western-blot鑒定結(jié)果表明陽(yáng)性病人的血清可特異性識(shí)別此條帶。 結(jié)論：從豬囊尾蚴cDNA