近交系胎鼠中腦前體細胞的體外培養(yǎng)以及骨髓基質細胞對其營養(yǎng)作用的初步研究.pdf

1、第一部分近交系大鼠胚胎中腦前體細胞體外培養(yǎng)研究 目的：體外培養(yǎng)近交系大鼠胚胎腹側中腦前體細胞(ventralmesencephalicprecursor,VMP)并誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergicneuron，DN)，為進一步研究DN定向分化的分子機制奠定基礎。 方法：取材胎齡n天(E11)的近交系大鼠胚胎VMP，體外用含堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，b

2、FGF)的無血清培養(yǎng)液擴增培養(yǎng)7天，然后換用含L一抗壞血酸-2-磷酸酯倍半鎂鹽(L-Ascorbicacid-2-phosphatesesquimagnesiumsalt，AA-2P)的特殊培養(yǎng)液誘導分化7天，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并繪制生長曲線。分別以TH(酪氨酸羥化酶)、β．Tubulin(微管蛋白)、Nestin(巢蛋白)、GFAP(神經(jīng)膠質纖維酸性蛋白)抗體標記DN、神經(jīng)元、前體細胞、星型膠質細胞，鑒定VMP分化情況，流

3、式細胞儀檢測分化細胞中的TH陽性細胞比例。 結果：近交系大鼠胚胎VMP在體外培養(yǎng)時能快速擴增并分化，培養(yǎng)14天后細胞總數(shù)擴增至培養(yǎng)前49．76±6．34倍，免疫熒光染色顯示β—TubulinIII陽性的神經(jīng)元中(71．33±20．42)％為TH陽性的DN，后者占細胞總數(shù)的(24．85±12．85)％。細胞體系中還包括一些前體細胞和星形膠質細胞等。流式細胞儀檢測顯示TH陽性神經(jīng)元數(shù)占神經(jīng)元總數(shù)的75．45％。 結論：近交系

4、大鼠胚胎VMP在合適的體外培養(yǎng)條件下能夠快速增殖，經(jīng)誘導能定向分化為較高比例的DN，可以作為深入研究DN定向分化分子機制的細胞模型。 第二部分骨髓基質細胞促進中腦前體細胞增殖及分化作用的實驗研究 目的：觀察骨髓基質細胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)對VMP體外擴增和定向分化的影響，并分析其可能機理。 方法：分別取材E¨大鼠胚胎VMP、成年大鼠BMSC進行體外培養(yǎng)，并建立二者的共培養(yǎng)體系。

5、體外擴增7天的VMP分別加入普通分化液、BMSC分化液、BMSC+VMP共培養(yǎng)分化液進行誘導分化，觀察細胞生長情況，分化期末行免疫熒光染色，統(tǒng)計三組細胞中TH陽性細胞占總細胞數(shù)的比例并比較分析。 結果：誘導分化7天后，對照組、BMSC分化液組和BMSC+VMP共培養(yǎng)分化液組中細胞數(shù)分別較培養(yǎng)前擴增44．13+4．75倍、60．63±5．25倍、64．00±7．63倍。TH陽性細胞比例分別為(18．76±5．20)％、(23．49