周圍神經(jīng)細胞懸液對體外培養(yǎng)的骨髓基質干細胞誘導分化的影響.pdf

1、背景與目的：帕金森病(PD)是常見的慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)變性疾病之一，病因及發(fā)病機制不明。其病理學的變化主要為黑質多巴胺(DA)能神經(jīng)元變性、缺失，導致紋狀體DA不足。目前PD的治療策略主要是控制臨床癥狀，這種治療策略不能夠阻止疾病的進行性發(fā)展。細胞移植為PD提供了能夠延緩疾病進展甚至根治的方法?？晒┮浦驳募毎麖脑缙诘腄A能腎上腺嗜鉻細胞、胚胎黑質細胞發(fā)展為神經(jīng)干細胞、骨髓基質干細胞(MSCs)，而MSCs作為移植細胞則具有

2、明顯優(yōu)勢。MSCs存在于骨髓間質中，具有自我復制能力：不僅可以分化為造血細胞，在特定條件下還可以分化為非造血細胞；MSCs來源豐富、采集方便：可自體回輸，不會發(fā)生免疫排斥反應；體外擴增迅速，短時間內可以達到治療所需的細胞數(shù)量；容易轉入外源基因。因此，MSCs成為細胞移植治療PD的最理想細胞來源之一。目前研究者多采用細胞因子或化學藥物等方法調控MSCs分化，在體外擴增到一定數(shù)量級后再進行移植。 微環(huán)境對于細胞的分化是最有利的條件。

3、有實驗表明周圍神經(jīng)組織能夠促進黑質細胞生長。周圍神經(jīng)中除神經(jīng)軸突外，主要包含雪旺細胞(SCs)和成纖維細胞(Fibroblast)。SCs是周圍神經(jīng)系統(tǒng)膠質細胞，掘報道，SCs能夠分泌20余種神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞外基質及細胞黏附因子，為軸突基質提供支持。已證明SCs能夠促進神經(jīng)元軸突的再生，誘導軸突再生、延長，有利于受損神經(jīng)在組織結構上修復、再生，在功能傳導上再通。SCs在體外具有抑制膠質細胞生成，促進神經(jīng)元快速生長的作用。將人胚胎干細胞

4、與SCs共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SCs營造的微環(huán)境可以誘導大多數(shù)干細胞分化為神經(jīng)元。有實驗證實周圍神經(jīng)可以促進黑質細胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，過表達FGF-20的SCs能夠促進Nurr-1 神經(jīng)干細胞轉化為酪氨酸羥化酶(TH)陽性的神經(jīng)元。但是，SCs的獲得存在技術復雜、所需試劑昂貴、SCs純度不高等缺陷。 關于Fibroblast報道較少。Fibroblast由胚胎時期的間充質細胞發(fā)展而來，是結締組織中最常見的細胞，具有分泌功能，可以以自分

5、泌和旁分泌的方式產生細胞外基質成分，如胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)等。IGF-1 具有胰島素樣抑制蛋白分解作用，同時也促進蛋白質合成，對正常組織細胞的增殖、分化、再塑和維護起十分重要的作用。IGF-1 可促進神經(jīng)細胞的存活，及促進視網(wǎng)膜神經(jīng)元的發(fā)育和CNS多級神經(jīng)元的生成。bFGF、EGF在包括神經(jīng)系統(tǒng)在內的各種組織形成過程中發(fā)揮重要作用。 目前研究者能夠在體

6、外實驗中將MSCs誘導為神經(jīng)元樣細胞，表達神經(jīng)元特有的表面標志。本實驗利用細胞培養(yǎng)模型，模擬體內中腦微環(huán)境，將周圍神經(jīng)細胞懸液與MSCs混合建立共培養(yǎng)體系，觀察MSCs向DA能神經(jīng)元誘導分化的情況，目的是尋求體外誘導MSCs定向分化為DA能神經(jīng)元的最佳條件，為PD的細胞及基因治療奠定實驗基礎。 方法： (1) MScs的分離、培養(yǎng)及純化雄性SD大鼠，無菌條件下暴露股骨和脛骨骨髓腔，獲取骨髓液。采用貼壁篩選法，將骨髓液接種

7、于含10﹪胎牛血清(FBS)的低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)液中，置于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后首次換液。以后每3～4d換液一次，待貼壁細胞生長融合后，胰酶消化傳代。將3～5代的MSCs接種于十二孔板中，待細胞生長達80﹪～90﹪融合時開始進行誘導分化。 (2) 周圍神經(jīng)細胞懸液的獲取2.5﹪苯丙巴比妥鈉腹腔麻醉300～350g重的SD大鼠(雌雄不拘)，無菌條件下取雙側坐骨神經(jīng)，

8、用顯微外科鑷子從神經(jīng)束中逐條抽取神經(jīng)纖維剪碎，移入盛有按1∶1比例混合的0.5﹪胰蛋白酶和0.06﹪膠元蛋白酶的離心管內37℃水浴90分鐘，加入細胞培養(yǎng)液終止酶反應，離心后將細胞稀釋成3×10<'5>/L，置于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中備用。 (3) 實驗分組如下：L-DMEM培養(yǎng)基中加入FBS(體積分數(shù)15﹪)和bFGF(10ng/ml)預誘導MSCs24h后，分為對照組：不另加任何試劑。實驗組

9、：①MSCs+周圍神經(jīng)細胞懸液組；②MSCs+周圍神經(jīng)細胞懸液+中腦條件培養(yǎng)基組。 整個誘導過程中，于倒置顯微鏡下密切觀察細胞形態(tài)變化，并在誘導第7d時進行神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體(NSE)、TH免疫細胞化學檢測。分別計數(shù)NSE、TH陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。 結果： (1) MSCs在體外條件培養(yǎng)呈增殖性生長，傳代后貼壁迅速，3～4d擴增1倍。 (2) bFGF預誘導24h后細胞數(shù)量明顯增加，

10、部分細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形；部分細胞具有神經(jīng)元形態(tài)學特征：折光性增強，胞體逐漸變成卵圓形或圓形，不帶突起或向兩極伸出突起。 (3) 各實驗組于誘導7d后出現(xiàn)不同數(shù)量的NSE、TH陽性神經(jīng)元樣細胞。實驗組與對照組NSE細胞陽性率、TH細胞陽性率有顯著差異。 (4) 對照組未見TH陽性細胞，MSCs+周圍神經(jīng)細胞懸液組可見少量TH陽性細胞，MSCs+周圍神經(jīng)細胞懸液+中腦條件培養(yǎng)基組可見數(shù)量較多的TH陽性細胞。 結