蛋白激酶C alpha抑制劑逆轉(zhuǎn)腎癌多藥耐藥的研究.pdf

1、本文應(yīng)用體外研究的方法，在PKC亞型水平探討腎細(xì)胞癌的多藥耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)，為腎細(xì)胞癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)分三部分： 1、采用Westem Blotting技術(shù)檢測(cè)30例腎癌組織及其周圍正常組織胞漿、胞膜中PKCα的表達(dá)。 2、采用基因工程技術(shù)構(gòu)建整合有PKCα基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的真核表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法在體外將PKCα基因?qū)肴四I癌786-0細(xì)胞，利用熒光倒置顯微鏡、Westem Blo

2、t、RT-PCR檢測(cè)PKCα基因的表達(dá)情況；觀察PKCα激動(dòng)劑Calphostin C、抑制劑PMA作用前后PKCα/786-0細(xì)胞中PKCα轉(zhuǎn)位狀態(tài)；檢測(cè)PKCαcDNA對(duì)腎癌786-0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MDR相關(guān)基因MDR1、MRP1、LRP的表達(dá)變化；采用MTT方法測(cè)定PKCα基因轉(zhuǎn)染對(duì)腎癌細(xì)胞耐藥性的影響。 3、RT-PCR觀察PKCα激動(dòng)劑Calphostin C、抑制劑PMA作用前后MDR1基因表達(dá)變化；以M

3、TT法測(cè)定Calphostin C、PMA對(duì)腎癌細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：測(cè)定阿霉素(ADM)與PKC激動(dòng)劑以及與PKC抑制劑協(xié)同作用后，786-0細(xì)胞和腎癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞系PKCα/786-0耐藥性的變化。 研究方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料： 主要試劑：786-0人腎癌細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)；PKCαcDNA全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框架(Open Reading Frame；ORF)、羧基端融合綠色熒光蛋白(C-terminal f

4、usion to Green Fluorescent ProteinP)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA-DEST47、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司； QIAprep Miniprep Kit購(gòu)自QIAGEN公司；G418：美國(guó)Gibercol BRL公司產(chǎn)品；用20mmol/L的HEPES稀釋成100μg/ml；0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌；保存于-20℃?zhèn)溆?；Calphos

5、tin C、ADM購(gòu)自Sigama公司；PMA購(gòu)自上?？党晒?；PKCα抗體購(gòu)自博士德公司； M-PER Mammalian Protein Extraction Regent試劑購(gòu)自PIERCE公司；第二抗體羊抗兔IgG、組蛋白Ⅲ-S、魚精蛋白均為Sigma公司產(chǎn)品。主要儀器：溫育箱、切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、高壓鍋、冰箱、顯微照相裝置、紫外/可見(jiàn)光光度計(jì)、低溫超速離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、超聲粉碎機(jī)、轉(zhuǎn)印儀、搖床、電泳儀、自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀

6、、-70℃深凍冰箱、流式細(xì)胞儀、烤片機(jī)、熒光倒置顯微鏡等。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、腎癌組織及其周圍正常組織胞漿、胞膜中PKCα的表達(dá)。 選取2001年-2003年我院經(jīng)手術(shù)切除的腎癌組織及其周圍正常組織的石蠟標(biāo)本各30例，均經(jīng)病理證實(shí)。男21例，女9例。年齡37歲～77歲，平均57.0歲。左側(cè)腎癌16例，右側(cè)腎癌14例。25例病例行經(jīng)腹腎癌根治手術(shù)，4例行經(jīng)腰腎癌根治手術(shù)，1例行經(jīng)腰腎切除術(shù)。所有病例均為初發(fā)，術(shù)前

7、未行放、化療和免疫治療。病理分期參照Robson分期法，組織學(xué)分級(jí)參照Cleveland Clinic分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)PKCα在腎癌腫瘤組織和臨近正常組織胞漿、胞膜中的表達(dá)。 2、細(xì)胞培養(yǎng)。 細(xì)胞置于37℃，飽和濕度，含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10％新生小牛血清的RPMI1640，每2-3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3、構(gòu)建pcDNA-DEST47-PKCα

8、-GFP表達(dá)載體。創(chuàng)建羧基端融合綠色熒光蛋白的pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達(dá)載體。 4、基因轉(zhuǎn)染786-0細(xì)胞以pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達(dá)載體作為目的基因，以熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的即時(shí)表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染效率。 5、PKCα/786-0細(xì)胞株的篩選建立與鑒定786-0 細(xì)胞系G418篩選試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性克隆，收集后傳代擴(kuò)增，命名為PKCα/786-0細(xì)胞株。 6、PKCα激動(dòng)劑

9、、抑制劑PMA作用前后PKCα786-0細(xì)胞中PKCα轉(zhuǎn)位變化。 7、RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)MDR1、MRP1、LRP表達(dá)。 8、MTT方法測(cè)定PKCα基因轉(zhuǎn)染對(duì)腎癌細(xì)胞耐藥性的影響。 9、RI-PCR觀察PKCα激動(dòng)劑、抑制劑作用前后MDR1基因表達(dá)變化。 10、MTT法測(cè)定Calplrestin C、PMA對(duì)腎癌細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。 11、測(cè)定阿霉素(ADM)與PKC激動(dòng)劑以及

10、與PKC抑制劑協(xié)同作用后，786-0細(xì)胞和腎癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞系PKCα/786-0耐藥性的變化。 研究結(jié)果： 1、PKCα在腎癌腫瘤組織胞漿、胞膜中的表達(dá)與腫瘤病理分期、細(xì)胞分級(jí)相關(guān)。 2、PKCα cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后， NCBI BLAST驗(yàn)證為所需基因片斷。 3、pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達(dá)載體對(duì)786-0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：786-0細(xì)胞利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pcDNA-DEST47-PKCα-GF

11、P表達(dá)載體后，未見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常顆?；蚩张莼?。24小時(shí)后熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的即時(shí)表達(dá)，加入G418后第2天即出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，第7天可見(jiàn)個(gè)別區(qū)域細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)，細(xì)胞島處細(xì)胞呈增生象，第14天散在的細(xì)胞幾乎全部死亡(對(duì)照組細(xì)胞也全部死亡)，細(xì)胞島處細(xì)胞密度進(jìn)一步增高、區(qū)域擴(kuò)大。第20天時(shí)熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)說(shuō)明pcDNA-DEST47-PKCα-GFP表達(dá)載體己轉(zhuǎn)染到786-0細(xì)胞內(nèi)，該細(xì)胞命名為PKCα/78

12、6-0。熒光倒置顯微鏡證實(shí)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的陽(yáng)性高表達(dá)。結(jié)果經(jīng)Westem Blot驗(yàn)證，DNA不同轉(zhuǎn)染條件均出現(xiàn)了明顯印跡，說(shuō)明存在PKCα蛋白的高表達(dá)，轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR也證實(shí)轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞中存在PKCα基因的高表達(dá)。 4、PKCα/786-0細(xì)胞株中，PKCα主要位于胞漿，呈彌漫分布，核周表達(dá)極少處于未激活狀態(tài)。熒光顯微鏡檢測(cè)激活/抑制狀態(tài)下PKCα-GFP的分布結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抑制劑PMA處理后，PKCα從胞漿內(nèi)

13、，迅速分布到核內(nèi)和核膜處，胞漿內(nèi)幾乎無(wú)表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入激活狀態(tài)。而加入Calphostin C處理后，PKCα的分布與未786-0細(xì)胞相似，PKCα有重新歸位于胞漿，核周熒光表達(dá)少，從而進(jìn)入抑制狀態(tài)。激活/抑制PKCα狀態(tài)下，胞漿和胞膜均發(fā)生PKCα-GFP的轉(zhuǎn)位。 5、KCα與MDR相關(guān)基因的RT-PCR結(jié)果，經(jīng)FluorChem凝膠分析系統(tǒng)分析。MDR1在PKCα/786-0表達(dá)中增加，而MRPl和LRP在轉(zhuǎn)染前后差異不大，表

14、明腎癌轉(zhuǎn)染細(xì)胞系PKCα/786-0的MDR1表達(dá)水平高于腎癌786-0細(xì)胞。 6、786-0細(xì)胞對(duì)ADM的IC<,50>為7.8015e<'-7>(5.7046e<'-7>～1.0669e<'-6>)；PKCα/786-0對(duì)ADM的IC<,50>為1.6588e<'-6>(1.1621e<'-6>～2.3677e<'-6>)。PKC激動(dòng)劑PMA聯(lián)合ADM處理PKCα/786-0的IC<,50>為2.6794e<'-6>(2.0

15、521e<-6>～3.4983e<'-6>)；PKC抑制劑CalphostinC聯(lián)合ADM處理PKCa/786-0的IC<,50>為9.2506e<'-8>(5.9337e<'-8>～1.4422<'e-7>)。 7、Calphostin C、PMA作用后MDR1基因表達(dá)分別出現(xiàn)升高和降低。 研究結(jié)論： 1、KC-α在腎癌腫瘤組織中存在膜轉(zhuǎn)位；PKCα在腎癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起了重要的調(diào)控作用。 2、PK

16、Cα在腎癌組織胞膜中高表達(dá)，在腎癌組織胞漿中低表達(dá)，并且與腎癌的病理分期和細(xì)胞分級(jí)密切相關(guān)。 3、PKCα基因可被成功轉(zhuǎn)染入人腎癌細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)。 4、PKC在胞膜與胞液中均有分布，與其活性狀態(tài)有關(guān)。持續(xù)的PKC激活，可能在細(xì)胞增殖、分化及腫瘤發(fā)生等方面起著重要的作用。PKCα特異抑制劑Calphostin C通過(guò)抑制PKCα的膜轉(zhuǎn)位使人腎癌細(xì)胞處于失活狀態(tài)，不能對(duì)相應(yīng)底物產(chǎn)生相關(guān)作用。 5、蛋白激酶C-cDNA