子宮內(nèi)膜癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)及其臨床意義.pdf

1、研究背景:
　　 子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖器官中常見的三大惡性腫瘤之一，其約占女性生殖道惡性腫瘤的20％-30％，近年來子宮內(nèi)膜癌在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，2008年全球新發(fā)子宮內(nèi)膜癌1880000，410000女性死于子宮內(nèi)膜癌，甚至在部分發(fā)達(dá)國家，子宮內(nèi)膜癌成為婦科惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害女性健康。美國每年有約4萬例新發(fā)子宮內(nèi)膜癌病例，2011年新發(fā)子宮內(nèi)膜癌更增

2、至46470例，有8120例死于子宮內(nèi)膜癌。我國子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率也呈逐年升高趨勢，己接近甚至超過宮頸癌的發(fā)病率。根據(jù)其與雌激素的關(guān)系分為Ⅰ型（雌激素依賴型）和Ⅱ型（非雌激素依賴型）。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌癌細(xì)胞分化好，雌、孕激素受體表達(dá)陽性，預(yù)后較好;Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌，惡性程度高，預(yù)后差，雌、孕激素受體不表達(dá)或弱表達(dá)。盡管同卵巢癌、宮頸癌相比，子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后較其他生殖器官惡性腫瘤要好，但是子宮內(nèi)膜癌的5年生存率并不令人滿意，子宮內(nèi)膜癌的5年生存

3、率在Ⅰ～Ⅱ期為83％，在Ⅲ期5年生存率73％，Ⅳ期5年生存率約為62％。
　　 近年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。表觀遺傳學(xué)修飾主要表現(xiàn)形式有:DNA甲基化(DNA methyaltion)、組蛋白修飾(histone modification)、染色體重塑(chromatin remodeling)和小RNA(mi croRNA)調(diào)控等。這些表觀修飾在不改

4、變DNA堿基序列的前提下調(diào)控基因的表達(dá)而在細(xì)胞中形成獨特的表型，影響細(xì)胞基因的表達(dá)，并將此影響隨細(xì)胞分裂而遺傳下去。因此表觀修飾是一類高于基因水平的基因調(diào)控機(jī)制，是將基因型與表型聯(lián)系起來的紐帶。其中DNA甲基化是基因主要的表觀遺傳修飾形式，目前通過對抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的過度甲基化研究，認(rèn)為抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的過度甲基化是抑癌基因失活的一個重要機(jī)制。
　　 DACH1(Cell fate determination f

5、actor Dachshund DACH1)是Hammond在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的與果蠅dac基因同源的基因，dac基因是果蠅視網(wǎng)膜決定（retinal determination，RD）信號通路（包括ey/Pax6、So/Six、eya/Eya等）的主要成員，dac基因能單獨誘導(dǎo)果蠅異位眼的形成，且對細(xì)胞分化方向起決定作用。研究發(fā)現(xiàn)，DACH1蛋白在乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)缺失或低表達(dá)，提示DACH1基因可能是一種新的抑癌基因。

6、
　　 本研究通過檢測DACH1基因啟動子在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系、子宮內(nèi)膜癌、正常子宮內(nèi)膜組織中的甲基化狀態(tài)，比較DACH1蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系及子宮內(nèi)膜癌、正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)的差異，分析DACH1蛋白的表達(dá)與DACH1基因啟動子甲基化之間表達(dá)的相關(guān)性。并探討DACH1基因啟動子甲基化與子宮內(nèi)膜癌臨床、病理特征間的關(guān)系，分析DACH1基因啟動子的甲基化在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為子宮內(nèi)膜癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供新

7、的依據(jù)。
　　 第一部分不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中DACH1基因啟動子甲基化的狀態(tài)及其與DACH1蛋白表達(dá)的關(guān)系
　　 目的:
　　 檢測不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A, KLE中DACH1基因啟動子甲基化的差異。探討DACH1基因啟動子甲基化與不同類型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
　　 材料與方法:
　　 1.子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，SPEC

8、-2為本實驗室所存，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系KLE，ECC-1，HEC-1-A由王晨光教授惠贈。
　　 采用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中DACH1基因啟動子甲基化狀態(tài)。
　　 2.采用Westernblot法檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中DACH1蛋白的表達(dá)，DACH1蛋白表達(dá)陽性的

9、Hela細(xì)胞作為該實驗的陽性對照。分析DACH1蛋白的表達(dá)與DACH(I)基因啟動子甲基化之間表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 一、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中高分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系Ishikawa，ECC-1未檢測到DACH1基因啟動子甲基化產(chǎn)物，中分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系HEC-1-A、低分化子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系KLE中DACH1基因啟動子甲基化陽性，漿液性腺癌子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系SPEC-2中DACH1基因啟動子甲基化陽性。

10、r>　　 二、DACH1蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa，ECC-1，SPEC-2，HEC-1-A，KLE中均有表達(dá)，但在低分化子宮內(nèi)膜癌KLE、漿液性腺癌內(nèi)膜癌細(xì)胞系SPEC-2中表達(dá)較弱。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中DACH1基因啟動子甲基化存在差異，DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)在人類子宮內(nèi)膜癌特別是低分化子宮內(nèi)膜癌及Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制中起著重要的作用。
　　

11、2.DACH1蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系SPEC-2、KLE中的低表達(dá)與DACH1基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)有關(guān)。
　　 第二部分子宮內(nèi)膜癌DACH1基因啟動子甲基化及其與患者臨床病理特征的關(guān)系
　　 目的：
　　 探討子宮內(nèi)膜癌組織中DACHl基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院及山東大學(xué)第二醫(yī)院2004年2月-2008年

12、8月經(jīng)病理檢查證實的子宮內(nèi)膜癌患者80例,行全面分期手術(shù),取其新鮮癌組織,部分組織用10％甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,其中1張行HE染色復(fù)診,部分組織放-70℃冰箱冷凍備用?；颊吣挲g31-72歲,平均54.6歲；按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO,2000)提出的內(nèi)膜樣癌組織3級分類法,該80例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本中病理學(xué)分級為G1級的有21例,占26.25%,病理學(xué)分級為G2級的有18例,占22.50%,病理學(xué)分級為G3級有41例,占51.

13、25%。手術(shù)病理分期：Ⅰ期患者51例,占63.75%,Ⅱ期患者15例,占18.75%,Ⅲ期患者11例,占13.75%,Ⅳ期患者3例,占3.75%。按病理類型分類,子宮內(nèi)膜樣腺癌共53例,占66.25%,漿液性乳頭狀腺癌共16例,占20%,透明細(xì)胞癌共11例,占13.75%。80例標(biāo)本中子宮肌層浸潤≤1/2者61例,占76.25%,子宮肌層浸潤1/2的患者共19例,占23.75%。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例,占17.5%,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例,占8

14、2.5%。
　　 采用甲基化特異性PCR (MSP)法檢測子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài),并分析DACH1基因啟動子甲基化與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期、組織病理學(xué)分級、肌層浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)類型、年齡等臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系,探討DACH1基因啟動子甲基化與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。DACH1基因啟動子甲基化在不同組織中陽性率的比較,及其表達(dá)與各臨床病理指標(biāo)之間關(guān)系的比較采用x2檢驗和校正

15、x2檢驗。
　　 2.選取同期(2008年)因功能失調(diào)性子宮出血行診斷性刮宮患者病理證實為正常子宮內(nèi)膜組織20例作為對照。采用Western法檢測80例子宮內(nèi)膜癌子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織20例中DACH1蛋白的表達(dá),DACH1蛋白表達(dá)陽性的Hela細(xì)胞作為該實驗的陽性對照。比較DACH1蛋白在各種組織中的表達(dá)的差異,分析DACH1蛋白的表達(dá)與DACH1基因啟動子甲基化之間表達(dá)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　

16、一、80份子宮內(nèi)膜癌組織中,24份組織DACH1基因啟動子甲基化陽性,其甲基化率為30%(24/80)；20份正常子宮內(nèi)膜組織中,僅1份組織DACH1基因啟動子甲基化陽性,其甲基化率為5%(1/20),兩者甲基化率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。
　　 二、子宮內(nèi)膜癌組織中,DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)與病理分級、病理類型有關(guān),G1-G2癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化率為18%(7/39),顯著低于G3者(41%

17、,17/41),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中DACH1基因啟動子的甲基化率為23%(12/53),顯著低于特殊類型子宮內(nèi)膜癌(44%,12/27),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而DACH1基因啟動子的甲基化狀態(tài)與患者年齡、手術(shù)病理分期、肌層浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P0.05)。
　　 三、在DACH1基因啟動子呈甲基化狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌組織中DACH1蛋白呈現(xiàn)不表達(dá)或者低表達(dá)狀態(tài),而在DACH1基因啟

18、動子呈未甲基化狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中DACH1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。24例子宮內(nèi)膜癌組織樣本DACH1的表達(dá)水平與DACH1啟動子區(qū)甲基化程度進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)二者之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.30,P0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.低級別的子宮內(nèi)膜癌中DACH1基因啟動子的甲基化率高,提示DACH1基因啟動子的甲基化可能與患者的不良預(yù)后有關(guān)。
　　 2. DACH1基因啟動子的高甲基化狀態(tài)在