RASSF1A基因在子宮內(nèi)膜癌中甲基化狀態(tài)及表達(dá).pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國家，發(fā)病率居女性生殖道惡性腫瘤首位，死亡率居第二位，高發(fā)年齡為50～61歲。近年來，由于環(huán)境、生活方式等因素的共同影響，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，大家廣泛認(rèn)可的相關(guān)因素有：長期持續(xù)的雌激素刺激，患者自身體質(zhì)原因如肥胖、糖尿病、高血壓、不孕或絕經(jīng)延遲，遺傳因素。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的、伴隨許多分子生物學(xué)改變的多因素共同作用的結(jié)果。隨著人

2、類基因組測序工程的順利完成，近年來從分子層面研究子宮內(nèi)膜癌基因改變成為研究的熱點(diǎn)。
　　 DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的作用下，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶環(huán)的第5位碳原子上，是目前己知的哺乳動物唯一的自然化學(xué)修飾方式，其本質(zhì)是在不改變DNA堿基序列的前提下，對DNA進(jìn)行化學(xué)修飾，從而影響基因下游產(chǎn)物表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA甲基化多發(fā)生在CpG島位點(diǎn)，CpG島是長度＞200bp，C+G的含量≥50％的DNA序

3、列，多位于基因的啟動子區(qū)域。正常細(xì)胞的CpG島處于非甲基化狀態(tài)，當(dāng)抑癌基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化時(shí)，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，抑癌功能喪失。越來越多的研究證明，腫瘤組織中存在抑癌基因的高甲基化狀態(tài)及表達(dá)產(chǎn)物減少或缺失，DNA啟動子甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。
　　 Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(Ras associated domain family1A，RASSF1A)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因，其cDNA編碼產(chǎn)物

4、是分子量為38800的蛋白多肽，RASSF1A蛋白在正常組織中100％表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控，通過多種途徑抑制細(xì)胞的過度生長、分化，促進(jìn)細(xì)胞衰老、凋亡。當(dāng)發(fā)生基因啟動子甲基化時(shí)，可能使編碼產(chǎn)物RASSF1A蛋白表達(dá)減少或缺失，抑制細(xì)胞過度增殖的作用消失，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
　　 目的：關(guān)于RASSF1A基因甲基化與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究在國內(nèi)鮮有報(bào)道，本文旨在通過MSP法檢測子宮內(nèi)膜癌中RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及RAS

5、SF1A蛋白表達(dá)情況，揭示RASSF1A基因甲基化與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。
　　 方法：收集2008—2010年河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院、第四醫(yī)院手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本40例（患者術(shù)前均未行放、化療），同時(shí)選取行全子宮切除正常增生期子宮內(nèi)膜40例（患者術(shù)前無異常子宮出血，半年內(nèi)未行激素治療）。新鮮標(biāo)本取出后立即置入-80℃冰箱保存，以備提取組織DNA，同時(shí)取部分新鮮組織標(biāo)本經(jīng)10％中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4

6、u m連續(xù)切片，供免疫組織化學(xué)試驗(yàn)所用。
　　 應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)檢測RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)，MSP的基本原理：模板DNA經(jīng)NAOH變性形成單鏈，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，甲基化的DNA胞嘧啶保持不變，未甲基化的DNA胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，利用未甲基化的胞嘧啶可以被亞硫酸氫鈉脫氨基變成尿嘧啶的原理，設(shè)計(jì)甲基化與非甲基引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以此檢測甲基化狀態(tài)。通過檢測子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜中RASSF1A基因啟

7、動子區(qū)甲基化狀態(tài)，比較兩組之間甲基化率的差異。
　　 采用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜RASSF1A蛋白表達(dá)情況：甲醛溶液固定的內(nèi)膜組織經(jīng)過洗滌脫水和石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。RASSF1A蛋白免疫組化染色后表達(dá)在細(xì)胞漿，為棕黃色顆粒，呈彌漫性分布，尤以腺體處表達(dá)最為明顯。陽性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)：在高倍鏡視野下(×400)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)不少于100，分別計(jì)算陽性細(xì)胞百分比及細(xì)胞染色強(qiáng)度，并予以評分：

8、
　　 評分陽性細(xì)胞數(shù)染色深度
　　 O分＜5％無色；
　　 1分5～25％淡黃色；
　　 2分26～50％黃色；
　　 3分51～75％棕褐色；
　　 4分＞75％RASSF1A蛋白陽性表達(dá)=陽性細(xì)胞百分比×染色深度：
　　 O～2分陰性（-）
　　 3～8分陽性(+)
　　 9～12分強(qiáng)陽性(++)
　　 結(jié)果：
　　 1.RASSF1A基因甲基

9、化狀態(tài)：40例子宮內(nèi)膜癌中，27例癌組織存在RASSF1A基因啟動子甲基化，甲基化頻率67.5％(27/40);40例正常子宮內(nèi)膜，5例組織存在RASSF1A基因啟動子甲基化，甲基化頻率12.5％(5/40)。子宮內(nèi)膜癌RASSF1A基因啟動子甲基化率明顯高于正常子宮內(nèi)膜，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=25.208，P=O．000＜0.01）。
　　 2.RASSF1A蛋白表達(dá)情況：40例子宮內(nèi)膜癌中，17例RASSF1A蛋白

10、表達(dá)陽性，表達(dá)率42.5％(17/40);40例正常子宮內(nèi)膜RASSF1A蛋白陽性表達(dá)100％(40/40)。子宮內(nèi)膜癌中RASSF1A蛋白陽性表達(dá)率明顯低于正常子宮內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=32.281，P=O．000＜0.01)。
　　 結(jié)論：子宮內(nèi)膜癌組織中，存在RASSF1A基因高甲基化及RASSF1A蛋白顯著低表達(dá)或缺失，由此可以推斷：
　　 1.RASSF1A基因啟動子甲基化可能造成該基因失活的原因，表達(dá)