RASSF2A基因在卵巢癌中的轉(zhuǎn)錄表達及其啟動子甲基化狀態(tài)的研究.pdf

1、研究背景:
　　卵巢癌是女性系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌是最常見的組織學類型，占卵巢惡性腫瘤的85％-90％。由于卵巢位于盆腔深部，發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，缺乏有效的早期診斷方法，臨床初診患者70-80％已屬中晚期。近年來，雖然腫瘤細胞減滅術(shù)和各種化療方法有了迅速發(fā)展，但其5年生存率無明顯改善，仍徘徊在30-40％，已經(jīng)成為嚴重威脅婦女健康的主要腫瘤，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。因此，研究卵巢癌發(fā)病的分子生物學機制，從分

2、子水平揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，研發(fā)早期診斷技術(shù)以及探索新的藥物治療靶點是目前的研究熱點。
　　近年來，隨著表觀遺傳學的發(fā)展，人們逐步認識到表觀遺傳學的改變和遺傳學的改變一樣共同參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤不僅是遺傳學疾病，同時也是表觀遺傳學疾病。DNA甲基化作為表觀遺傳學的主要修飾形式，是在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，甲基被動的增添在胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶的過程，是目前表觀遺傳學中研究最多、最深入的領(lǐng)域。DNA的異常甲基化

3、和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而且是腫瘤中的早期、頻發(fā)事件。研究證實基因啟動子區(qū)高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要機制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機制。
　　惡性腫瘤患者外周血中游離DNA含量明顯高于正常健康人，而且具備與原發(fā)腫瘤組織一致的惡性細胞生物學行為，因此分析外周血中游離DNA的甲基化狀態(tài)，可以反映實體腫瘤的甲基化水平，對于惡性腫瘤的早期診斷極具臨床應(yīng)用價值，可作為一種潛在的無創(chuàng)性腫瘤標志物。
　　DNA甲基化具

4、有可逆性，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，使之重新表達，從而達到抑制腫瘤生長的目的，是目前腫瘤基因治療的研究熱點。5-氮雜2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)是目前最為常見的核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長及侵襲。
　　Ras通過和不同的效應(yīng)分子結(jié)合來調(diào)節(jié)不同的生命活動，既能促進腫瘤的發(fā)生，又能抑制生長，如促進凋亡，細胞周期阻滯等。Ras的負效應(yīng)調(diào)節(jié)因子參與了Ras的生長抑制作用，其中研究最多的是R

5、ASSF家族。目前為止，共發(fā)現(xiàn)這個家族有10個成員(RASSF1-10)。大量研究已證實RASSF1A啟動子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是腫瘤癌變過程中的頻發(fā)事件，其參與了包括卵巢癌在內(nèi)的多種實性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，是上皮性卵巢癌中最常見的甲基化抑癌基因，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標。與RASSF1A具有高度同源性的RASSF2A在結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中表達降低或缺失與其甲基化有關(guān)。RASSF2A基因作為

6、Ras的下游效應(yīng)物，在Ras激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的負向調(diào)節(jié)作用，扮演抑癌基因的角色。但有關(guān)RASSF2A基因與卵巢癌的關(guān)系尚無文獻報道。
　　本實驗采用甲基化特異性PCR檢測上皮性卵巢癌組織及其相對應(yīng)的血清標本中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測RASSF2A mRNA在卵巢癌組織中的表達情況，分析RASSF2A啟動子異常甲基化與其轉(zhuǎn)錄表達的相關(guān)性，甲基化狀態(tài)在兩種組織標本中的相關(guān)性，以及RASSF2A啟動

7、子甲基化與卵巢癌患者臨床病理特征（年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。并使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細胞系SKOV3，分析去甲基化作用前后RASSF2A表達水平、甲基化狀態(tài)的改變，以及對細胞生物學活性的影響，探討RASSF2A啟動子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，血清RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌早期診斷中的價值，初步探索并尋找治療卵巢癌的新靶點。
　　第一部分卵巢癌組織中RAS

8、SF2A基因轉(zhuǎn)錄表達及其甲基化狀態(tài)的檢測
　　目的:
　　檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達情況，分析RASSF2A基因啟動子異常甲基化與轉(zhuǎn)錄表達的相關(guān)性，及其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系，初步探討RASSF2A基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化水平與其表達缺失之間的關(guān)系，研究RASSF2A基因在上皮性卵巢癌中的作用機制

9、。
　　方法:
　　本研究采用RT-PCR方法檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中RASSF2A基因mRNA表達情況，同時采用甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR，MSP)方法檢測不同組織中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.RASSF2A mRNA在三組卵巢組織中的表達RASSF2A mRNA在正常卵巢及良性卵巢腫瘤組織中的陽性表達率分別為90％

10、(9/10)、85.7％(12/14)，而在卵巢癌組織中RASSF2A的表達率明顯下降，僅為42.6％(20/47)。三組中RASSF2AmRNA的表達存在顯著性差異(x2=13.198，p=0.001)。三組中兩兩比較，卵巢癌組與良性卵巢腫瘤組，卵巢癌組與正常卵巢組差異均有統(tǒng)計學意義(x2=8.057，p=0.005; x2=7.427，p=0.006)，良性卵巢腫瘤組與正常卵巢組比較，差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.098，p=0.75

11、4)。
　　2.三組卵巢組織中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態(tài)卵巢癌組織中有51.1％(24/47)的組織存在RASSF2A甲基化，而在良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織中均未檢測到此現(xiàn)象。卵巢癌組織中RASSF2A甲基化陽性率明顯高于良性卵巢腫瘤、正常卵巢組織(x2=18.513，p=0.001)，差異具有顯著性。
　　3.RASSF2A啟動子甲基化與基因表達及卵巢癌的關(guān)系在卵巢癌組織中，RASSF2A甲基化陰性的組織中其mRN

12、A的表達率較高，為82.6％(19/23)，而在RASSF2A甲基化陽性的組織中其mRNA的表達明顯下降，僅為33.3％(8/24)，差異具有顯著性（x2=11.665，r=-0.498，p=0.001）。RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移之間無明顯的相關(guān)性。但隨著患者年齡的增加，RASSF2A甲基化有升高趨勢。
　　結(jié)論:
　　1.RASSF2A mRNA在卵巢癌組織中的表達

13、明顯低于正常卵巢和良性卵巢腫瘤組織，呈低表達或表達缺失。
　　2.RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化是卵巢癌中的頻發(fā)事件，是卵巢癌中作為抑癌基因的RASSF2A失活的重要原因之一。
　　3.RASSF2A啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)錄沉默在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分卵巢癌患者血清標本中RASSF2A基因甲基化水平及臨床意義
　　目的:
　　檢測上皮性卵巢癌、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織相配對的

14、血清標本中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并分析其與卵巢癌患者年齡、病理類型、臨床分期、組織分級、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關(guān)系，初步探討檢測血清RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢癌診斷中的作用。
　　方法:
　　本研究采用MSP方法檢測第一部分實驗中卵巢組織相對應(yīng)的血清標本中RASSF2A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1.三組血清標本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)卵巢癌組血清中36.2％

15、(17/47)的標本存在RASSF2A甲基化，而在良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組中均未檢測到此現(xiàn)象。卵巢癌組血清標本RASSF2A甲基化陽性率明顯高于良性卵巢腫瘤組、正常卵巢組(x2=11.414，p=0.003)，差異具有顯著性。
　　2.RASSF2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在血清標本與組織標本中的關(guān)系結(jié)合第一部分實驗結(jié)果，在發(fā)生RASSF2A甲基化的24例組織標本中，其對應(yīng)的血清標本中有17例亦發(fā)生了甲基化;在未發(fā)生基因甲基化的23例

16、組織標本中，其對應(yīng)的血清標本也未發(fā)現(xiàn)甲基化現(xiàn)象。兩者有明顯的相關(guān)性，差異具有顯著性(x2=25.524, r=0.737, p=0.000)。
　　3.血清標本中RASSF2A甲基化水平與臨床特征的關(guān)系血清標本中RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的臨床病理特征之間無明顯的相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.血清標本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化具有腫瘤特異性，是卵巢癌中的早期、頻發(fā)事件。
　　2.血清標本中RASSF

17、2A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)可以間接反應(yīng)原發(fā)腫瘤DNA甲基化水平，是原發(fā)腫瘤的有效參考指標。
　　3.檢測血清標本中RASSF2A啟動子區(qū)甲基化水平可作為卵巢癌的表觀遺傳學標記物，有助于卵巢癌的早期診斷。
　　第三部分5-aza-dC對卵巢癌細胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化及其表達的影響
　　目的:
　　本研究使用去甲基化試劑5-aza-dC作用于卵巢癌細胞系SKOV3，分析去甲基化作用前后RASSF2A基因

18、甲基化及其表達水平的改變，以及SKOV3細胞生物學功能的影響，初步探討并尋找治療卵巢癌的新靶點。
　　方法:
　　本研究采用RT-PCR方法檢測5-aza-dC作用前后卵巢癌細胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達水平;MSP方法檢測其甲基化狀態(tài)的改變;MTT和流式細胞術(shù)檢測藥物對卵巢癌細胞生物學行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.去甲基化試劑對SKOV3中RASSF2A基因表達的影響5-aza-dC作用后使

19、卵巢癌細胞系SKOV3中RASSF2A mRNA表達水平明顯增高。
　　2.去甲基化試劑對SKOV3中RASSF2A啟動子甲基化的影響5-aza-dC作用后使卵巢癌細胞系SKOV3中RASSF2A基因甲基化水平下降。
　　3.去甲基化試劑對卵巢癌細胞生物學行為的影響5-aza-dC藥物干預(yù)后，SKOV3細胞活性和抗凋亡能力均明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.去甲基化試劑5-aza-dC可使RASSF2A表達升高或重