RASSF1A基因異常甲基化及MicroRNA調(diào)控與膀胱癌復(fù)發(fā)的研究.pdf

1、第一部分膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素分析
　　目的:分析我院膀胱癌行保留膀胱手術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生率及其危險(xiǎn)因素。
　　材料與方法:452例初發(fā)膀胱癌患者，于2003年1月～2010年6月在我院行保留膀胱的手術(shù)治療（膀胱部分切除或經(jīng)尿道腫瘤切除），術(shù)后病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌。所有患者隨訪2年，收集患者的一般資料（年齡、性別、吸煙史等）、腫瘤學(xué)特征（腫瘤數(shù)目、分期、分級(jí)）、術(shù)后治療方案和術(shù)后復(fù)發(fā)的頻度。按2年內(nèi)復(fù)發(fā)的頻度分為無復(fù)發(fā)組、低

2、復(fù)發(fā)組（2年內(nèi)復(fù)發(fā)1次）和高復(fù)發(fā)組（2年內(nèi)復(fù)發(fā)2次及以上），比較各組臨床病理特征的差異。對(duì)2年內(nèi)有復(fù)發(fā)的低級(jí)別腫瘤患者按照復(fù)發(fā)后腫瘤分級(jí)是否改變分組，又分為無進(jìn)展組（2年內(nèi)腫瘤分級(jí)未增高）和進(jìn)展組（2年內(nèi)腫瘤分級(jí)增高），比較2組臨床病理特征的差異。
　　結(jié)果:452例患者2年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)204例(45.1％)，其中127例為低復(fù)發(fā)組，77例為高復(fù)發(fā)組。而其余248例為無復(fù)發(fā)組。三組患者吸煙、腫瘤分級(jí)、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目、接受規(guī)范膀胱

3、灌注化療和接受干擾素治療的比例有非常顯著性差異(P＜0.001);年齡、性別、術(shù)后全身化療、放療和BCG治療比例無顯著性差異(P＞0.05)。復(fù)發(fā)的低級(jí)別腫瘤共110例，其中無進(jìn)展組79例，進(jìn)展組31例。兩組患者吸煙、腫瘤分期有非常顯著性差異(P＜0.001);年齡、性別、腫瘤數(shù)目和術(shù)后是否規(guī)范的膀胱灌注化療的比例無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:術(shù)前吸煙史、腫瘤分級(jí)、分期、腫瘤多發(fā)和未接受規(guī)范膀胱灌注化療是膀胱癌患者術(shù)后

4、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。而在術(shù)后隨訪中發(fā)現(xiàn)，初發(fā)腫瘤分期較高和術(shù)后繼續(xù)吸煙的患者在復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤分級(jí)增高的危險(xiǎn)性增加。
　　第二部分人膀胱癌細(xì)胞中RASSF1A基因甲基化狀態(tài)分析
　　目的:了解T24膀胱癌細(xì)胞株中RASSF1A基因甲基化狀態(tài)及其與細(xì)胞增殖、侵襲能力的關(guān)系。
　　材料與方法:用濃度分別為0.1μmol/l、2.5μmol/l和12.5μmol/l的DNA甲基化酶抑制劑5-雜氮脫氧胞苷（5-aza-dc）處理T24膀

5、胱癌細(xì)胞株，分別為低劑量組、中劑量組和高劑量組。然后各組用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長抑制率，流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期改變，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。RT-PCR法檢測(cè)RASSF1A基因轉(zhuǎn)錄水平，Western-blot檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平。甲基化特異性PCR(MSP法)檢測(cè)藥物處理后RASSF1A基因甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:5-aza-dc低劑量、中劑量和高劑量組對(duì)T24膀胱癌細(xì)胞株24h細(xì)胞生長抑制率分別為7.621

6、、8.297和8.478。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示空白組、對(duì)照組和低劑量、中劑量、高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為2.5％、2.9％、4.2％、5.7％和13.8％。各組細(xì)胞周期無明顯變化。Transwell法檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞侵襲受明顯抑制，侵襲抑制率呈劑量相關(guān)性。MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)空白組和對(duì)照組RASSF1A呈完全甲基化狀態(tài)，低劑量組呈部分甲基化狀態(tài)，中劑量和高劑量組呈無甲基化狀態(tài)。RT-PCR和Western-blot檢測(cè)顯示藥物處理后RASSF1A

7、基因轉(zhuǎn)錄水平升高、蛋白質(zhì)表達(dá)增加。
　　結(jié)論:在T24膀胱癌細(xì)胞株中RASSF1A基因呈完全甲基化狀態(tài)。甲基化酶抑制劑5-aza-dc可抑制該基因甲基化，使RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平升高、蛋白質(zhì)表達(dá)增加，從而使細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡增加、細(xì)胞侵襲能力減弱。
　　第三部分轉(zhuǎn)染miR-143和miR-29a對(duì)人膀胱癌細(xì)胞生長和侵襲能力的影響及其與RASSF1A基因甲基化的關(guān)系
　　目的:研究miR-143和miR-29a對(duì)T2

8、4膀胱癌細(xì)胞株生長、侵襲能力的影響，及其與RASSF1A基因甲基化的關(guān)系。
　　材料與方法:化學(xué)合成miR-143和miR-29a的模擬物(mimics)，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入T24膀胱癌細(xì)胞株。通過RT-PCR驗(yàn)證miRNA mimics的轉(zhuǎn)染效果。根據(jù)轉(zhuǎn)染mimics的不同，分為WT組（不作任何處理的T24細(xì)胞）、NC組（轉(zhuǎn)入不含miRNA的mimics的陰性對(duì)照）、M1組（轉(zhuǎn)入含miR-143的mimics）、M2組（轉(zhuǎn)入含miR-2

9、9a的mimics）。流式細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期改變，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，RT-PCR和Western-blot檢測(cè)RASSF1A基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)，MSP檢測(cè)RASSF1A基因甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:RT-PCR證實(shí)兩組mimics轉(zhuǎn)染成功。WT組、NC組、M1組和M2組的細(xì)胞凋亡率分別為2.5％、3.4％、12.4％和13.3％。M1組和M2組S期細(xì)胞有所增加。NC組、M1組和M2組細(xì)胞侵襲抑

10、制率分別為0.020、0.165和0.132，M1和M2轉(zhuǎn)染組高于NC組，有顯著性差異(P＜0.05)。RT-PCR和Western-blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-29a的M2組RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)含量較NC組增加，M1組無明顯變化。MSP檢測(cè)顯示，WT組、NC組和M1組RASSF1A基因均呈完全甲基化，M2組呈部分甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染miR-143和miR-29a可使T24膀胱癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡增加、侵襲能力減弱

11、。轉(zhuǎn)染miR-29a可以部分抑制RASSF1A基因甲基化，從而使該基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)增加。
　　第四部分不同復(fù)發(fā)頻率的人膀胱癌組織中RASSF1A基因甲基化狀態(tài)和miR-143、miR-29a表達(dá)分析
　　目的:探討人膀胱癌組織RASSF1A基因甲基化狀態(tài)以及miR-143、miR-29a表達(dá)與膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系。
　　材料與方法:選擇2008年～2009年我院膀胱癌患者行膀胱部分切除30例，按不同復(fù)發(fā)頻率分為無復(fù)

12、發(fā)組、低復(fù)發(fā)組（2年內(nèi)復(fù)發(fā)1次）、高復(fù)發(fā)組（2年內(nèi)復(fù)發(fā)2次及以上），每組10例。MSP法檢測(cè)各組細(xì)胞RASSF1A甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測(cè)miR-3p-143、miR-3p-29a、miR-5p-29a的表達(dá)。
　　結(jié)果:各組患者性別、年齡、腫瘤數(shù)量、分期無顯著性差異，而高復(fù)發(fā)組的高級(jí)別腫瘤比例較高。無復(fù)發(fā)組、低復(fù)發(fā)組、高復(fù)發(fā)組中RASSF1A基因完全或部分甲基化的比例分別為40％、80％和100％，有顯著性差異(P＜0.05

13、)。三組患者miR-3p-143含量分別為122.68、3.49和0.77，miR-3p-29a含量分別為246.99、65.60和62.25，miR-5p-29a含量分別為11.30、3.65、2.20。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示，miR-3p-143表達(dá)無復(fù)發(fā)組明顯高于另兩組，低復(fù)發(fā)組亦高于高復(fù)發(fā)組，有顯著性差異(P＜0.05)。miR-3p-29a和miR-5p-29a表達(dá)無復(fù)發(fā)組高于另兩組，有顯著性差異(P＜0.05)，但低復(fù)發(fā)組和高復(fù)發(fā)組

14、間無明顯差異(P＞0.05)。RASSF1A基因甲基化但腫瘤2年內(nèi)未復(fù)發(fā)組與無甲基化但腫瘤2年內(nèi)復(fù)發(fā)組之間比較，miR-3p-143含量分別為99.98±44.90和5.57±1.73，有顯著性差異(P＜0.05); miR-3p-29a含量為133.27±19.64和210.78±187.52，miR-5p-29a含量為7.47±1.07和5.49±1.85，無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:人膀胱癌組織中RASSF1A