宮頸癌ITIH5基因啟動(dòng)子和第1外顯子甲基化狀態(tài)及其臨床意義研究.pdf

1、目的：檢測(cè)人類間α胰蛋白酶H5重鏈(ITIH5)基因啟動(dòng)子區(qū)和第1外顯子在宮頸癌中甲基化狀態(tài)與ITIH5表達(dá)的關(guān)系，分析ITIH5基因甲基化狀態(tài)與宮頸癌發(fā)生及惡性進(jìn)展的相關(guān)性并探究其臨床意義。
　　方法：①.選用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MS-PCR)和亞硫酸鹽-基因組測(cè)序法(BGS)分別檢測(cè)50例宮頸癌組織、54例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和29例正常宮頸組織標(biāo)本中ITIH5啟動(dòng)子區(qū)和第1外顯子甲基化狀態(tài)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT

2、-PCR)法檢測(cè)ITIH5基因表達(dá)。②.進(jìn)一步通過MSP和BGS法檢測(cè)應(yīng)用去甲基化藥物前后宮頸癌細(xì)胞系中ITIH5基因啟動(dòng)子和第1外顯子甲基化狀態(tài)，并用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)用藥前后ITIH5表達(dá)。
　　結(jié)果：①.ITIH5啟動(dòng)子甲基化率在宮頸癌標(biāo)本組中較宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和正常宮頸標(biāo)本組明顯升高(χ2=46.59,P<0.001)，在CIN組顯著高于正常宮頸組(χ2=5.37,P<0.

3、05),而在CINI組明顯低于CINII-III組，差異具有顯著性(χ2=5.83,P<0.05)。②.ITIH5mRNA的表達(dá)量在宮頸癌中顯著低于正常宮頸及CIN(P<0.05),在CIN中的表達(dá)明顯低于正常宮頸(P<0.05),參照組中CINI的表達(dá)明顯高于CINII-III,各組差別有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。③.ITIH5甲基化率同宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(校正χ2=4.562,P=0.029)；與年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、病理

4、類型、肌層浸潤(rùn)、脈管浸潤(rùn)之間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。④.基因ITIH5啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)缺失顯著相關(guān)(t=8.336，P=0.000)。⑤.HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系及慢病毒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HPV16DNA宮頸癌細(xì)胞的ITIH5甲基化率較HPV陰性細(xì)胞系或慢病毒只轉(zhuǎn)染未整合HPV16DNA的宮頸癌細(xì)胞明顯升高,而ITIH5mRNA在前者中表達(dá)卻明顯低于后者。從而提示HPV感染宮頸癌細(xì)胞系后影響ITIH5基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，進(jìn)而影響基因

5、表達(dá)。⑥.去甲基化藥物可使HPV陽(yáng)性及慢病毒轉(zhuǎn)染HPV16宮頸癌細(xì)胞系ITIH5去甲基化,并使ITIH5在宮頸癌細(xì)胞中mRNA及蛋白水平均表達(dá)顯著增高且無(wú)藥物濃度依賴性。
　　結(jié)論：①ITIH5基因啟動(dòng)子區(qū)和第1外顯子的高甲基化在宮頸癌中頻繁發(fā)生,是宮頸癌ITIH5基因表達(dá)下降乃至沉默的原因,與宮頸癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不良預(yù)后有關(guān)。ITIH5基因高甲基化有望成為宮頸癌的篩查、診斷及判斷預(yù)后的基因標(biāo)志物。②宮頸癌細(xì)胞系候選腫瘤抑制基

6、因ITIH5甲基化和表達(dá)與HPV有關(guān)，HPV陽(yáng)性呈高甲基化，基因低表達(dá)；HPV陰性則低甲基化,基因高表達(dá),當(dāng)慢病毒轉(zhuǎn)染HPV16E6、E7、E6/E7至HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系后，其ITIH5呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，去甲基化藥物能夠降低ITIH5基因啟動(dòng)子的高甲基化水平,提高ITIH5基因的mRNA及蛋白表達(dá),提示HPV感染可能是ITIH5基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的一個(gè)重要原因；由啟動(dòng)子甲基化引起的抑癌基因失表達(dá)，也許是HPV感染介入宮頸惡性病變的一