宮頸癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因啟動(dòng)子甲基化的熒光偏振檢測(cè)研究.pdf

1、宮頸癌是一種嚴(yán)重威脅著女性生命和健康、由HPV感染導(dǎo)致的惡性腫瘤,發(fā)病率在全世界女性腫瘤中位居第二,死亡率位居第一,且目前發(fā)病率與死亡率仍呈上升趨勢(shì)。多數(shù)患者在確診時(shí)已達(dá)中晚期,因此大多要在手術(shù)治療后接受放化療。目前的化療藥物對(duì)晚期宮頸癌的治療有一定效果,但仍存在嚴(yán)重的耐藥性,導(dǎo)致預(yù)后差、生存期短。在大部分宮頸癌患者標(biāo)本中,可檢出表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)高水平表達(dá)。近

2、年,以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)為基礎(chǔ)的分子靶向藥物成為宮頸癌個(gè)體化用藥治療的研究熱點(diǎn),但臨床試驗(yàn)卻并未獲得預(yù)期療效。研究發(fā)現(xiàn),在部分宮頸癌患者中,EGFR基因存在甲基化修飾,可能與EGFR靶向治療藥物效果較差有關(guān)。因此,對(duì)EGFR基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測(cè),有利于指導(dǎo)宮頸癌EGFR-TKI個(gè)體化治療和去DNA甲基化臨床用藥的實(shí)施。
　　熒光偏振技術(shù)(fluorescence polarization,F

3、P)是一種通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記分子的熒光偏振值變化判斷分子量改變的技術(shù)。偏振熒光的強(qiáng)度與熒光標(biāo)記分子分子量的大小呈正相關(guān),因此通過(guò)檢測(cè)熒光偏振強(qiáng)度值的變化即可判斷待測(cè)熒光標(biāo)記分子是否參與了反應(yīng)。本研究利用此技術(shù)在液相環(huán)境中均相檢測(cè)的能力和效率的優(yōu)勢(shì),對(duì)宮頸癌患者EGFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)研究。
　　目的:建立基于熒光偏振技術(shù)的EGFR啟動(dòng)子甲基化標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法與體系,檢測(cè)并分析宮頸癌患者組織標(biāo)本中EGFR基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),并初

4、步探討其與肺癌相關(guān)EGFR-TKI敏感突變、宮頸癌病因HPV感染之間的聯(lián)系,為指導(dǎo)宮頸癌的個(gè)體化治療提供新思路和分子診斷技術(shù)方法。
　　方法:首先建立熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系。提取健康志愿者血液淋巴細(xì)胞DNA,對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾,一半經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理。設(shè)計(jì)EGFR啟動(dòng)子序列通用引物,擴(kuò)增序列后測(cè)序,同時(shí)構(gòu)建甲基化與非甲基化序列標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體。設(shè)計(jì)EGFR啟動(dòng)子甲基化特異性探針,利用標(biāo)準(zhǔn)品作為模板建立熒光偏振檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系,

5、對(duì)體系各項(xiàng)反應(yīng)條件與敏感性、穩(wěn)定性、特異性等進(jìn)行研究和優(yōu)化。隨后利用已建立的檢測(cè)方法對(duì)宮頸癌組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)檢測(cè),并與測(cè)序法結(jié)果進(jìn)行比較。同時(shí),檢測(cè)標(biāo)本中肺癌相關(guān)EGFR-TKI敏感突變以及HPV感染型別。利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,分析EGFR啟動(dòng)子甲基化與肺癌相關(guān)EGFR-TKI敏感突變、HPV感染等因素之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:本研究成功構(gòu)建了基于熒光偏振技術(shù)的EGFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)

6、體系,對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系的反應(yīng)條件、靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均進(jìn)行了研究和優(yōu)化。本方法最低檢測(cè)濃度為50拷貝/μl,最低檢測(cè)含量可達(dá)10％,敏感度高。利用該體系成功檢測(cè)了宮頸癌標(biāo)本組織中 EGFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),本方法檢測(cè)EGFR啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果與直接測(cè)序法結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。99例宮頸癌標(biāo)本中EGFR啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性37例,陽(yáng)性率為37.4%。未檢測(cè)出EGFR基因18、19、21外顯子EGFR-TKI敏感突變。HPV感染型別中HPV1

7、6陽(yáng)性29例,HPV18陽(yáng)性12例,HPV58陽(yáng)性4例,HPV52陽(yáng)性4例。HPV16感染陽(yáng)性中EGFR啟動(dòng)子甲基化18例,占62.1%。HPV16陽(yáng)性樣本中EGFR啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性比率最高。
　　結(jié)論:本研究方法檢測(cè)EGFR啟動(dòng)子甲基化操作簡(jiǎn)單高效,靈敏度與準(zhǔn)確度較高,為臨床宮頸癌個(gè)體化治療相關(guān)檢測(cè)提供了新技術(shù)。本研究中,宮頸癌標(biāo)本中EGFR啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率為37.4%,未發(fā)現(xiàn)肺癌相關(guān)EGFR-TKI敏感基因突變,HPV16感