大鼠脊髓橫斷后應用慢病毒介導SiNgR-199的療效分析.pdf

1、本研究擬構建NgR特異性小干擾RNA慢病毒重組體，優(yōu)化NgR特異性小干擾RNA的合成、遞呈，通過病毒轉染技術體外進行大鼠原代皮層神經元細胞RNA干擾，驗證其有效性并確定最佳感染復數(shù)(MOI)；最后在大鼠脊髓橫斷損傷模型證實慢病毒介導的NgR特異性siRNA能夠成功長期下調NgR蛋白表達，一定程度上促進損傷大鼠神經功能恢復和神經纖維再生。 目的： 1．在前期實驗的基礎上，設計、構建介導NgR特異性小干擾RNA序列的慢病毒重

2、組體。 2．驗證于大鼠原代皮層神經元細胞培養(yǎng)中慢病毒重組體可以成功轉染神經元細胞，引發(fā)內源性NgR基因沉默。并確定體內最佳轉染濃度。 3．觀察大鼠脊髓橫斷損傷模型應用慢病毒重組體沉默NgR基因后對神經軸突再生和神經功能恢復的影響，為進一步應用臨床試驗提供理論依據(jù)。 方法： 1．按照Elbashir等設計原則和siRNA表達載體的要求，設計構建NgR特異siRNAl99慢病毒重組體，并進行酶切鑒定及基因測序

3、；通過轉染293T細胞確定最佳轉染濃度和感染復數(shù)(MOI值)。 2．體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經元細胞，培養(yǎng)后第7天，進行不同滴度的重組慢病毒轉染，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染情況，確定最佳MOI值及活體應用病毒量，應用實時熒光定量PCR檢測內源性NgR基因沉默效果； 3．建立大鼠脊髓橫斷損傷模型；51只成年雌性S～D大鼠隨機分為假手術對照組(6只)、生理鹽水組(15只)、空慢病毒組(15只)、慢病毒重組體組(15只)，脊髓橫

4、斷損傷后7天皮層體感運動區(qū)分點微量注射給藥。損傷后8周(處死前1周)皮層體感運動區(qū)分點微量注射BDA示蹤劑順行示蹤。 4．傷后每周對大鼠的后肢運動功能進行神經功能行為學評分(BBB評分)；采用雙盲、雙人獨立觀察記錄法。給藥10天后熒光顯微鏡下觀察報告基因GFP表達情況；實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測注射區(qū)皮層神經元細胞NgR mRNA表達情況；免疫組化觀察NgR蛋白表達狀況，及脊髓損傷神經修復情況。9周后觀察脊髓損傷區(qū)神

5、經修復、再生情況。 結果： 1．構建的NgR特異性siRNA199慢病毒重組體經酶切鑒定，產物瓊脂糖凝膠電泳DNA片段約6.4Kbp，經基因測序儀測序，結果與設計序列完全相符，目的基因序列準確無誤，慢病毒重組體構建成功。 2．慢病毒重組體實現(xiàn)體外大鼠原代皮層神經元轉染，96小時后神經細胞開始表達綠色熒光，146小時表達綠色熒光最強；適合高效感染的MOI值為3；轉染192h后收集細胞進行實時熒光定量PCR檢測，結果

6、顯示目的基因抑制效率為61％，取得較滿意的效果。 3.損傷后1周在大鼠脊髓橫斷損傷模型中行皮層體感運動區(qū)分點微量注射給藥，給藥10d后取注射區(qū)腦組織行RT-PCR檢測NgR mRNA表達水平，結果顯示重組慢病毒注射組NgR mRNA的表達水平明顯低于生理鹽水注射組與空慢病毒注射組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；注射區(qū)腦組織冰凍切片貼片行免疫組化檢測NgR蛋白表達情況，生理鹽水組及空慢病毒組可見清晰陽性細胞，重組慢病毒組NgR

7、染色陽性顆粒明顯減少，從而說明在活體內大腦皮層微量注射慢病毒重組體轉染皮層神經元細胞后成功實現(xiàn)了NgR基因的沉默。 4.BBB評分結果：手術大鼠在損傷后最初都表現(xiàn)為喪失所有后肢運動功能，BBB評分為0分。損傷后4周內無明顯改變，第5周起，各組動物均出現(xiàn)不同程度的后肢運動，BBB評分最高為3分。隨后逐漸上升，至第8周時最高達到8分；各實驗組大鼠的神經功能均有一定程度的恢復，但各組間BBB評分提高程度無統(tǒng)計學顯著差異(P>0.05)

8、。 5.組織學和神經纖維染色檢查結果：重組慢病毒組脊髓橫斷損傷部位有更多髓鞘組織形成及膠質細胞增生；BDA順行神經示蹤觀察見重組慢病毒組有少量的軸突生長通過損傷區(qū)域，要明顯好于生理鹽水組及空慢病毒組。 結論： 設計、構建的NgR特異性siRNA199慢病毒重組體，能夠在大鼠體外原代皮層神經元轉染和體內皮層運動區(qū)注射后穩(wěn)定地實現(xiàn)RNA干擾，較長時間下調神經元的內源性NgR mRNA表達，并在一定程度上促進脊髓神經軸