人腦膠質(zhì)瘤白喉毒素受體表達(dá)水平與其病理級(jí)別相關(guān)性的探討.pdf

1、人腦膠質(zhì)瘤是一種惡性度高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，術(shù)后的化療是目前治療膠質(zhì)瘤必要手段之一。但由于膠質(zhì)瘤毛細(xì)血管形成的血腫瘤屏障的存在，選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物到達(dá)腦腫瘤組織一直是一個(gè)難題。近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，經(jīng)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的內(nèi)源性受體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)可能是腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)最有效的方法之一。 白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor，DTR)，也稱作肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子的膜結(jié)合前體(pro heparinbind

2、ing—epidermal growth factor，proHB—EGF)，是一個(gè)含有206個(gè)氨基酸的跨膜蛋白，它可以與白喉毒素特異性結(jié)合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用使其進(jìn)入細(xì)胞。DTR在平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)上均有表達(dá)。在疾病，如中風(fēng)、腦腫瘤的條件下，DTR在BBB中的表達(dá)大幅度上調(diào)；已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)表明，DTR蛋白在許多腫瘤組織中高表達(dá)，但在人腦膠質(zhì)瘤中是否也有表達(dá)并未見文獻(xiàn)報(bào)道

3、。 研究表明，白喉毒素的無(wú)毒突變體—CRM197，能夠作為一種安全有效的人類疫苗而使用。在對(duì)白喉毒素敏感的豚鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，DTR在豚鼠的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并檢測(cè)到CRM197載體蛋白可以安全有效地轉(zhuǎn)運(yùn)大分子的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP，40 kD)通過BBB，這充分證實(shí)它可以作為一種安全有效的載體，介導(dǎo)大分子物質(zhì)經(jīng)DTR進(jìn)行跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果使我們相信，DTR介導(dǎo)的跨細(xì)

4、胞轉(zhuǎn)運(yùn)可能成為一種更安全有效的腦內(nèi)大分子藥物的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。 本研究采用腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本，通過測(cè)定腦膠質(zhì)瘤組織中DTR的表達(dá)水平，與其病理級(jí)別相比較，分析腦膠質(zhì)瘤DTR的表達(dá)水平與其病理級(jí)別的相關(guān)性，為DTR介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方法應(yīng)用于臨床上腦腫瘤的化療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、實(shí)驗(yàn)材料 (一)標(biāo)本 材料和方法 2007年7月到2008年7月間，從中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)

5、院神經(jīng)外科手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤中，獲得32例新鮮的組織標(biāo)本。同時(shí)收集3例腦挫裂傷手術(shù)獲得的正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照組。32例患者中，男18例(56％)，女14例(44％)。年齡在25到76之間，平均年齡47歲。手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本立即于液氮中速凍后，置于—70℃超低溫冰箱中保存。所有關(guān)于人體的實(shí)驗(yàn)均符合赫爾辛基宣言，并取得了患者的知情同意。 (二)主要試劑 羊抗人DTR/proHB—EGF多克隆抗體，小鼠抗β—actin單

6、克隆抗體和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司：辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色試劑盒均購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司；免疫組化鏈霉親和素—過氧化物酶(SP)試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。 (三)主要儀器 勻漿機(jī)；電子分析天平；恒溫震蕩水浴箱；臺(tái)式低溫冷凍

7、離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；通用電泳儀；轉(zhuǎn)印儀；—70℃超低溫冰箱；恒溫冰凍切片機(jī)；液氮罐。 二、實(shí)驗(yàn)方法 (一)H&E(hematoxylin and eosin，H&E)染色 根據(jù)H&E染色結(jié)果按照WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)(2000)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行病理診斷和分級(jí)，每個(gè)病理級(jí)別為一組。 (二)Western Blot法 測(cè)定DTR在各病理級(jí)別中的表達(dá)水平，分析人腦膠質(zhì)瘤中DTR表達(dá)水平與其

8、病理級(jí)別間的相關(guān)性。 (三)免疫組化SP法 測(cè)定不同病理級(jí)別中DTR表達(dá)與分布，分析人腦膠質(zhì)瘤中DTR的表達(dá)水平與其病理級(jí)別間的相關(guān)性。 (四)圖像分析 Western Blot結(jié)果用Chemi Imager5500 V2.03軟件掃描，用捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)v3.3軟件定量分析顯色帶的整合光密度值(Integrated Density Value，IDV)。免疫組化結(jié)果用Motic Images Adva

9、nced3.2實(shí)時(shí)圖象分析系統(tǒng)采集照片并目標(biāo)平均光密度值(Average Optical Density，AOD)進(jìn)行半定量分析。 (五)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料結(jié)果用x±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用單因素方差分析的最小有意義差(the least significant difference，LSD)法。采用相關(guān)分析和一元線性回歸對(duì)人腦膠質(zhì)瘤DTR表達(dá)水平與其病理級(jí)別進(jìn)行

10、相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、H&E染色進(jìn)行人腦膠質(zhì)瘤的病理診斷與分級(jí) 根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類標(biāo)準(zhǔn)(2000)，32例人腦膠質(zhì)瘤中，Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)12例，Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)0例。每個(gè)病理級(jí)別為一組，共三組。3例腦挫裂傷手術(shù)獲得的正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照組。 二、Western Blot法測(cè)定DTR的表達(dá)水平 測(cè)定的DTR的表達(dá)水平取其IDV值與對(duì)應(yīng)β—act

11、in的IDV值的比值。DTR在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在對(duì)照組中不表達(dá)。在各病理級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中，DTR與對(duì)應(yīng)的β—actin的IDV值之比分別為0.1070±0.0265，0.1592±0.0322和0.2730±0.0425；兩兩組間比較，P=0.000，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ⅰ<Ⅱ<Ⅲ級(jí)；DTR的表達(dá)水平與其病理級(jí)別的相關(guān)分析，r=0.877，P=0.000，呈顯著正相關(guān)；進(jìn)行回歸分析，直線回歸方程為Y=0.083X+0.0127。

12、 三、免疫組化法測(cè)定DTR的分布與表達(dá)水平 免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組中DTR呈陰性表達(dá)，而每一級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有免疫反應(yīng)棕色陽(yáng)性顆粒分布，著色部位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核無(wú)著色。在各病理級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中，DTR的OD值分別為0.1923±0.0203，0.2084±0.0211，0.2455±0.0384，Ⅰ、Ⅱ級(jí)組間比較，P=0.008，Ⅰ、Ⅲ級(jí)和Ⅱ、Ⅲ級(jí)組間比較，P=0.000，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Ⅰ<Ⅱ

13、<Ⅲ級(jí)；腦膠質(zhì)瘤中DTR表達(dá)水平與其病理級(jí)別做相關(guān)分析，r=0.609，P=0.000，呈顯著正相關(guān)；進(jìn)行回歸分析，直線回歸方程為Y=0.026X+0.164。 討論： 本文利用人腦膠質(zhì)瘤組織首次證明了在不同病理級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤中，DTR的表達(dá)水平存在差異，且Ⅰ級(jí)<Ⅱ級(jí)<Ⅲ級(jí)，并與其病理級(jí)別呈顯著正相關(guān)關(guān)系。 DTR，也稱作proHB—EGF，是屬于表皮生長(zhǎng)因子超家族的肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(heparinbindi

14、ng—epidermal growth factor，HB—EGF)的膜結(jié)合前體[8]，它可以經(jīng)由蛋白水解分裂為有76—87氨基酸殘基的可溶性肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(soluble HB—EGF，sHB—EGF)。免疫組化結(jié)果顯示，在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，HB—EGF主要是以DTR形式表達(dá)的。體外的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，DTR的表達(dá)是由bEGF、EGF或TGF-α誘發(fā)的，而體內(nèi)的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生TGF—A和bEGF，這些現(xiàn)象提高了腫瘤衍生的多種

15、生長(zhǎng)因子相互調(diào)控他們的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的可能性，以及在刺激神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮了很重要的作用。同時(shí)，這些生長(zhǎng)因子交叉反應(yīng)也可能引起膠質(zhì)瘤中DTR的過量表達(dá)。隨著人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞成幾何級(jí)數(shù)生長(zhǎng)和病理級(jí)別的升高，這一作用可能被放大，從而使DTR的表達(dá)隨著病理級(jí)別的升高而增加。 DTR在人血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，可以介導(dǎo)與抗該受體的單克隆抗體連接的外源性藥物，經(jīng)胞吞胞吐作用轉(zhuǎn)運(yùn)到腦組織中。同時(shí)我們的研究發(fā)現(xiàn)，DTR在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，

16、提示該藥物可以進(jìn)一步特異地作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞。以白喉毒素的無(wú)毒突變體CRM197為載體，經(jīng)DTR介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)不用破壞BBB的屏障特性，就可以通過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腦，提示DTR介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可能成為一種新的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方式用來靶向的治療人腦膠質(zhì)瘤。 研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤中DTR的表達(dá)水平與其病理級(jí)別呈顯著正相關(guān)，且線性回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此可以推測(cè)，病理級(jí)別高的腦膠質(zhì)瘤患者，因?yàn)槠銬TR的表達(dá)水平較高，所以由DT及其類