RSCs移植聯(lián)合COP-1免疫治療對(duì)青光眼模型鼠RGCs的保護(hù)作用.pdf

1、第一章鼠青光眼模型的建立和視網(wǎng)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:建立鼠慢性青光眼模型，觀察各組鼠眼壓的變化。培養(yǎng)視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinalstemcells，RSCs)，鑒定并觀察其分化特點(diǎn)。
　　 方法:取正常成年SD大鼠，采用532-二極管激光行270°角膜緣血管網(wǎng)及三條淺層鞏膜靜脈光凝，建立鼠慢性青光眼模型。取正常成年SD大鼠眼球，仔細(xì)分離出睫狀體邊緣區(qū)的視網(wǎng)膜組織塊（包括色素組織），消化成單細(xì)胞懸液后置于含堿性

2、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、B27的無(wú)血清培養(yǎng)液中進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞的表型及分化特征。
　　 結(jié)果:成功建立21只大鼠慢性青光眼模型，在激光光凝后14d，眼壓達(dá)最高峰，其平均值為31.6±3.2mmHg，對(duì)側(cè)對(duì)照眼為16.8±1.7mmHg(P＜0.001)，21d后眼壓基本趨于穩(wěn)定狀態(tài);21d時(shí)各實(shí)驗(yàn)組眼壓差異無(wú)顯著性。培養(yǎng)的RSCs中干細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)絲蛋白(Nestin)表達(dá)

3、陽(yáng)性，細(xì)胞增殖標(biāo)志物5-溴脫氧尿核苷(BrdU)表達(dá)陽(yáng)性。RSCs分化細(xì)胞中神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)表達(dá)陽(yáng)性，膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論:采用532二極管激光角鞏膜緣血管網(wǎng)及淺層鞏膜靜脈光凝能成功升高鼠眼內(nèi)壓，建立大鼠慢性青光眼模型;睫狀體邊緣區(qū)的視網(wǎng)膜組織塊消化培養(yǎng)法能成功地培養(yǎng)出成年鼠RSCs，且RSCs能分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 第二章RSCs移植和CO

4、P-1聯(lián)合治療后青光眼模型鼠IFN-γ的表達(dá)差異
　　 目的:探討RSCs移植和多聚物-1（Copolymer-1，COP-1）聯(lián)合治療慢性青光眼模型鼠后眼內(nèi)房水及血中IFN-γ的表達(dá)差異，明確RSCs移植和COP-1聯(lián)合治療青光眼的機(jī)制。
　　 方法:采用532二極管激光光凝建立SD大鼠慢性青光眼模型，實(shí)驗(yàn)分為六組:①PBS/PBS治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射PBS，七天后玻璃體腔內(nèi)注射PBS;②PBS/RSCs治

5、療組:青光眼模型鼠后足皮下注射PBS，七天后玻璃體腔內(nèi)注射攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因的慢病毒載體(Lentivirus-GFP+)轉(zhuǎn)染的RSCs;③PBS/COP-1治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射0.2mgCOP-1，七天后玻璃體腔內(nèi)注射PBS;④RSCs/COP-1治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射0.2mgCOP-1，七天后玻璃體腔內(nèi)注射Lentivirus-GFP+轉(zhuǎn)染的RSCs;⑤青光眼模型組:不做任何治療;⑥正常對(duì)照組。采用EL

6、ISA檢測(cè)各組眼內(nèi)房水及血中IFN-γ含量;并采用hoechst染色觀察各組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells，RGCs)的凋亡情況。采用免疫組織化學(xué)及全視網(wǎng)膜鋪片觀察移植的RSCs的融合情況。
　　 結(jié)果:RSCs/COP-1治療組較其它組房水及血中IFN-γ的含量明顯減低(P＜0.05)，分別為2371.9ng/L和710.9ng/L，RSCs/COP-1治療組較其它組RGCs凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜

7、0.05)。移植的RSCs融合入宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層中。
　　 結(jié)論:RSCs移植和COP-1聯(lián)合治療可以通過(guò)減少慢性青光眼模型鼠眼內(nèi)房水及血中IFN-γ含量，阻止RGCs的凋亡，其機(jī)制之一可能與COP-1介導(dǎo)的自身性免疫保護(hù)作用及干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。移植的RSCs融合到宿主視網(wǎng)膜中。
　　 第三章RSCs移植和COP-1聯(lián)合治療對(duì)青光眼模型鼠RGCs的保護(hù)作用
　　 目的:探討RSCs移植和

8、COP-1聯(lián)合治療對(duì)慢性青光眼模型鼠RGCs的保護(hù)作用。
　　 方法:采用532二極管激光光凝建立SD大鼠慢性青光眼模型，實(shí)驗(yàn)分為四組:①PBS/PBS治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射PBS，七天后玻璃體腔內(nèi)注射PBS;②PBS/RSCs治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射PBS，七天后玻璃體腔內(nèi)注射RSCs;③PBS/COP-1治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射0.2mgCOP-1，七天后玻璃體腔內(nèi)注射PBS;④RSCs/COP-1

9、治療組:青光眼模型鼠后足皮下注射0.2mgCOP-1，七天后玻璃體腔內(nèi)注射RSCs;采用免疫組織化學(xué)、Real-timeRT-PCR、WesternBlot等方法研究各組視網(wǎng)膜中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、IGF-Ⅰ的表達(dá)差異，通過(guò)視網(wǎng)膜切片及TUNEL染色檢測(cè)各組RGCs的凋亡，并進(jìn)行RGCs計(jì)數(shù)。
　　 結(jié)果:RSCs/COP-1治療組較其它各組神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、IGF-Ⅰ蛋白及mRNA表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，同時(shí)RGC