內(nèi)蒙土壤蟲生真菌的分離鑒定及RNAi工程菌株構(gòu)建.pdf

1、蟲生真菌廣泛用于害蟲生物防治，具有安全，無污染，不易形成抗性等優(yōu)點，是發(fā)展害蟲綠色防控技術(shù)的一種重要選擇。土壤是一個巨大的蟲生真菌菌種庫，從土壤中分離、鑒定和篩選昆蟲病原真菌是真菌殺蟲劑研發(fā)的重要措施?；蚋牧寄苡行岣呦x生真菌的殺蟲效果，針對目標害蟲的RNAi敏感基因，在蟲生真菌中表達該基因的dsRNA片斷，是一種新的蟲生真菌基因改良途徑。
　　本文從內(nèi)蒙古自治區(qū)不同地區(qū)采集了26個土壤樣品，從中分離了26個菌株，并對其進行了鑒

2、定，測定了其中五個菌株對煙粉虱的生物活性。并且，以斜紋夜蛾SlDorsal基因為靶基因，構(gòu)建了沉默載體，并轉(zhuǎn)化球孢白僵菌Beuaveria bassiana，獲得了一株對斜紋夜蛾具有較強生物活性的工程菌株。具體研究結(jié)果如下：
　　主要依據(jù)菌落、分生孢子與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)性狀，以及分子生物學(xué)方法比對分析ITS1-5.8S-ITS4 rDNA基因和β-微管蛋白基因的同源性，對所分離的菌株進行了鑒定，其中，MS-10、MS-12、MS-

3、15為淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus；MS-25菌株確定為球孢白僵菌B. bassiana；MS-01、MS-06、MS-19為蠟蚧菌Lecanicillium attenuatum；MS-02、MS-03、MS-05、MS-08、MS-13、MS-16、MS-18、MS-22、MS-23、MS-24為蠟蚧菌Lecanicillium muscarium；MS-14為肉色筍殼菌Peniophora incarna

4、ta；MS-20為頂孢霉Schizophyllum commune；MS-04、MS-07、MS-21屬于枝孢菌屬Cladosporium，MS-26屬于裂褶菌霉屬 Acremonium，尚無法鑒定到種；而 MS-09和MS-17菌株形態(tài)上疑似擬青霉屬Paecilomyces，但未擴增到相應(yīng)的基因序列，尚無法鑒定。
　　測定了其中五個菌株 MS-25、MS-12、MS-15、MS-18、MS-10對二齡煙粉虱的致病力，在孢子懸浮液

5、濃度為108 spores/mL，處理后第10天MS-12、MS-15、MS-18、MS-25、MS-10菌株對煙粉虱的校正死亡率分別達到了92.4％、91.6%、89.9%、88.1%、86.7%，MS-18和MS-15致死中時間LT50為4.5 d，MS-10和MS-12為5.5 d，MS-10菌株的為6 d。
　　以球孢白僵菌Bb01菌株為出發(fā)菌株，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法構(gòu)建重組菌株。實驗發(fā)現(xiàn)，使用1%蝸牛酶+2%纖維素酶的組合

6、酶，在溫度30℃、pH7、0.7 mol/L NaCl穩(wěn)滲液下酶解5小時，獲得的原生質(zhì)體最多；通過30% PEG4000介導(dǎo)法將含有斜紋夜蛾SlDorsal基因片斷的重組載體轉(zhuǎn)化球孢白僵菌Bb01菌株原生質(zhì)體，篩選得到了1株能夠穩(wěn)定遺傳的重組菌株Bb01-SlDorsal（保藏號為：CCTCCM2015721）。
　　采用浸漬法測定了重組菌株Bb01-SlDorsal對二齡斜紋夜蛾幼蟲的毒力，在處理后第10天，Bb01-SlDor