產surfactin枯草芽胞桿菌168重組菌株構建及其對黃瓜枯萎病的控制作用.pdf

1、黃瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；虵usarium oxysporum f.sp.cucumerinum(Foc)引起的危害嚴重的土傳病害。防治黃瓜枯萎病的高效菌株枯草芽胞桿菌B006可產生脂肽類抗生素表面活性素surfactin和芬枯草菌素fengycin。前人研究證明脂肽類表面活性素surfactin通過促進芽胞桿菌生物膜形成以及在植物根部的定殖、誘導植物產生系統(tǒng)抗性等發(fā)揮生防作用。但對于surfactin是否能夠抑制根際病原菌的侵

2、染和在植株內的蔓延來控制病害的發(fā)生和發(fā)展尚缺乏依據。
　　本研究首先從生防芽胞桿菌B006菌株中克隆了編碼4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉移酶Sfp的sfp基因并連接到載體pDG1730上，并通過同源重組的方法將該基因整合到不產生surfactin的模式菌株B.subtilis168(B168)基因組中。轉化子于1％淀粉平板和5％血平板初步篩選，獲得不水解淀粉并產生溶血圈的重組菌株B168S。采用HPLC-ESI-MS對B168S在牛肉膏

3、蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h后的surfactin進行檢測，證明B168S可產生surfactin，sfp基因重組菌株構建成功。
　　對重組菌株B168S和B168的生物學特性的測定表明:B168和B168S在黃瓜根系分泌物培養(yǎng)基上菌落形態(tài)略有差異，B168S的菌落更厚。兩菌株接種于LB培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)24h后，B168S在液面處產生的生物膜較B168厚。平板對峙實驗表明B168S在CRE培養(yǎng)基上對Foc菌絲生長有一定的抑制作

4、用，抑制率R2/R1為1.22，而B168菌株無抑制作用。
　　采用組織印跡法對重組菌株B168S和原始菌株B168在黃瓜根部的定殖和分布狀態(tài)測定結果表明，B168S在黃瓜根中部和根尖處菌量明顯大于B168。采用平板菌落計數法對B168S和B168在黃瓜根各部位的定殖量測定結果表明，菌懸液（106 cfu· mL-1）浸泡90分鐘的黃瓜種子播種于無菌石英砂3天后，B168S在黃瓜根基部和根尖的定殖量分別為B168的2～3倍和9～1

5、0倍。
　　溫室盆栽實驗表明，用濃度為106 cfu· mL-1的B168S和B168菌懸液蘸根后，移栽到接種Foc孢子（105個·g-1）的病土中，移栽后第3周B168S和B168處理的防效分別為21.1％和17.9％;對不同高度黃瓜莖中Foc的組織分離結果表明，B168S處理后Foc在黃瓜莖內的相對高度低于B168和Foc處理，蔓延速度減慢。
　　以檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸作為單一有機酸的根分泌物培養(yǎng)液培養(yǎng)芽胞桿菌B006

6、，HPLC方法檢測各培養(yǎng)液中B006菌株產生的surfactin。結果表明，三種有機酸可改變surfactin的產量，并改變surfactin各同系物的比例。外源添加surfactin粗提物能夠促進芽胞桿菌生物膜的形成，從葡萄糖和琥珀酸培養(yǎng)液中獲得的surfactin粗提物A和B分別在50μM和10μM以上對芽胞桿菌B168和B168S生物膜的形成具有明顯促進作用。
　　上述結果進一步明確了surfactin可明顯促進芽胞桿菌在黃