枯草芽胞桿菌168蛋白酶基因?qū){豆激酶表達(dá)影響的研究.pdf

1、納豆激酶(Nattkoinase，NK)是納豆發(fā)酵過程中由納豆芽胞桿菌(Bacillus subtilis natto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶。納豆激酶具有纖溶活性，可預(yù)防和治療血栓疾病，它還可激活體內(nèi)的纖溶酶原，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量。通過枯草芽胞桿菌來表達(dá)納豆激酶基因是獲得納豆激酶的重要途徑之一。
　　枯草芽胞桿菌自身能分泌大量的胞內(nèi)蛋白酶和胞外蛋白酶，這使得純化枯草芽胞桿菌宿主所表達(dá)的異源蛋白酶變得困難，而且也使枯草芽胞桿

2、菌表達(dá)的異源蛋白容易被宿主所分泌的蛋白酶降解?？莶菅堪麠U菌自身所分泌的蛋白酶為將枯草芽胞桿菌開發(fā)為優(yōu)良異源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)宿主帶來許多障礙。因此，研究枯草芽胞桿菌所分泌的蛋白酶對其表達(dá)異源蛋白體系的影響有重要意義。
　　目前已知枯草芽胞桿菌168（Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168）能分泌8種蛋白酶，它們的基因分別為：nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wpr

3、A。本研究選擇了aprE、vpr、wprA這3種蛋白酶基因?yàn)榘袠?biāo)，重點(diǎn)研究了它們對枯草芽胞桿菌納豆激酶表達(dá)體系的影響。
　　采用超表達(dá)的方法來研究枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr和wprA這3種蛋白酶基因的超表達(dá)對該菌株表達(dá)重組納豆激酶基因的影響。將這3個(gè)蛋白酶基因分別克隆到表達(dá)載體pBE43上，然后重組表達(dá)載體（pBE43-aprE、pBE43-vpr、pBE43-wprA）分別在枯草芽胞桿菌168中表達(dá)。提取含有這3種超表

4、達(dá)蛋白的培養(yǎng)上清液，補(bǔ)加到枯草芽胞桿菌168表達(dá)重組納豆激酶的發(fā)酵對數(shù)期細(xì)胞中。通過纖維蛋白平板檢測納豆激酶酶活方法來觀察不同蛋白培養(yǎng)上清對納豆激酶表達(dá)活性的影響。初步結(jié)果表明：aprE的超表達(dá)上清液對納豆激酶表達(dá)有促進(jìn)作用，vpr的超表達(dá)上清液抑制納豆激酶的表達(dá)活性，wprA的超表達(dá)上清液對納豆激酶表達(dá)有輕微抑制作用。
　　采用基因敲除的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了宿主枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr和wprA這3種基因的單個(gè)缺失對枯草

5、芽胞桿菌168表達(dá)重組納豆激酶基因的影響。獲得3種蛋白酶基因的單缺失宿主菌株△aprE、△vpr和△wprA，并將重組納豆激酶表達(dá)載體pBE43-NA轉(zhuǎn)入這3種單缺失菌株進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失單個(gè)蛋白酶宿主菌所表達(dá)納豆激酶活性比原始菌株所表達(dá)的納豆激酶活性都要低，這說明宿主枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr或wprA基因的缺失不利于納豆激酶的表達(dá)活性提高。
　　綜合以上兩種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：在以枯草芽胞桿菌168作為宿主菌表達(dá)