口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A對細胞凋亡的影響及干擾3D基因?qū)Σ《疽种频挠^察.pdf

1、口蹄疫是由口蹄疫病原引發(fā)的主要侵害偶蹄動物組織的一種動物傳染性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為 A類動物傳染病之一，有7種血清型,含有超過70多個亞型，幾乎所有的類型間缺乏保護性免疫，因此給口蹄疫的防控帶來了較大的困難。近幾年在口蹄疫病毒的復(fù)制、細胞識別、病毒結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系等方面取得了較大的進展，但對病毒的致病機理仍然不是很清楚。針對口蹄疫病毒感染誘導(dǎo)宿主細胞凋亡的研究在國內(nèi)外相對較少。為了防治口蹄疫病毒的暴發(fā)，人們已經(jīng)開始著

2、力培育抗病毒轉(zhuǎn)基因動物模型，我們實驗室也先后培育出了5頭抗 O型口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬。為驗證其抗病毒能力，在細胞水平上對抗口蹄疫病毒的效率進行評價。
　　1.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A的表達活性驗證：利用分子生物學(xué)方法，按照基因庫中提供的 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3A全長序列設(shè)計引物，提口蹄疫病毒總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,以 cDNA作為 PCR擴增模板，通過 PCR擴增得到2B、3A基因的 DNA序列。將回收產(chǎn)物連接至

3、克隆載體上，測序驗證準(zhǔn)確后，再將含有目的基因3A、2B的克隆載體用雙酶切切割后，連接至真核表達載體 pEGFP-N1中，經(jīng)序列測定和雙酶切驗證得到重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-3A、pEGFP-N1-2B。用該質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染倉鼠腎細胞（BHK）,分別提取轉(zhuǎn)染48h后正常組細胞、pEGFP-N1和實驗組組細胞，加入蛋白裂解液進行裂解，裂解充分后收集蛋白上清，進行蛋白印記驗證及電泳分析。實驗表明：在轉(zhuǎn)染24小時后的細胞在倒置熒光顯微鏡下發(fā)出綠色

4、熒光，說明該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。經(jīng) Western blotting驗證，在41KD處可見一條亮帶，證明了融合蛋白3A-EGFP、2B-EGFP在倉鼠腎細胞中可以成功表達。
　　2.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對感染細胞凋亡的影響：用細胞流式儀檢測3A-EGFP、2B-EGFP融合蛋白對細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染24h后的細胞在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，經(jīng)過流式檢測儀顯示：3A-EGFP融合蛋白對細胞凋亡有促進作用，與對照組相比差異顯

5、著（P＜0.01）。而融合蛋白2B-EGFP對細胞產(chǎn)生的凋亡效果與對照組相比差異不明顯（P＞0.05）。
　　3.轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞的分離以及抗口蹄疫病毒（FMDV）的效應(yīng)研究：干擾片段SiRNA在抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬體細胞內(nèi)的抗病毒效果，采用膠原酶消化法和動物組織塊法兩種分離細胞的方法，成功獲得了抗病毒的轉(zhuǎn)基因豬成纖維細胞，提取細胞基因組 DNA,對含有 shRNA片段的基因序列進行 PCR驗證。檢測出在400bp處有亮條帶的

6、出現(xiàn)，正常豬卻沒有亮條帶出現(xiàn)，測序結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)含有一段外源的抗 FMDV的3D的 SiRNA片段。并在分離出的兩種成纖維細胞上接種了定量的口蹄疫病毒。通過產(chǎn)生的細胞病理變化（CPE）以及實時定量 PCR計算出了病毒在細胞中的含量,結(jié)果表明：接種相同劑量的病毒原液，抗口蹄疫病毒的轉(zhuǎn)基因豬和同日齡的正常豬成纖維細胞在抵抗病毒的效率有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因豬的成纖維細胞發(fā)生病變的時間要比正常豬發(fā)生病變的時間長，而且通過對兩種細胞進行病毒