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文檔簡介
1、目的:
膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi),膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第十一位,其形成過程復雜,多種基因參與其中,可分為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)、肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)和轉(zhuǎn)移性膀胱癌,其中20~30%的新發(fā)病例是MIBC[1]。MIBC的治療以根治性膀胱切除及盆腔淋巴結(jié)清掃為主,術(shù)后復發(fā)率高達30~45%,5年生存率為45~66%[2]。微轉(zhuǎn)移灶是局部治療MIBC失敗的主要原因之一;約50%新診斷的M
2、IBC患者已發(fā)生潛在的局部或遠處轉(zhuǎn)移,MIBC僅手術(shù)治療效果有時并不理想,以及部分患者不能通過手術(shù)完全切除病灶,臨床往往會輔以放、化療為主的治療手段。輔助化療可以使病理分期明確、有轉(zhuǎn)移證據(jù)的患者受益于系統(tǒng)化療,減少局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移復發(fā)的可能性。因此,輔助化療更早地被醫(yī)生和患者接受,因為疾病相關(guān)病死率越高的患者從輔助化療受益的程度也就越高。吉西他濱(Gemcitabine,GEM)是一種脫氧胞苷類似物.屬嘧啶類,是細胞周期特異性抗腫瘤代
3、謝類藥物,主要作用于S期細胞,抑制DNA合成,并可阻止細胞由G1期進入S期。GEM在全身多系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮了巨大的作用,已成為非小細胞肺癌、胰腺癌和肌層浸潤性膀胱癌術(shù)后化療的一線用藥[3]。臨床治療中GEM常與其他藥物聯(lián)用,發(fā)展出一系列的聯(lián)合治療方案都收到了較好的效果。值得關(guān)注的是,化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時,難免會使正常細胞收到一定的損害,產(chǎn)生相應(yīng)的毒副反應(yīng),如骨髓抑制,免疫功能下降等等?;熕幬飵淼母鞣N不良反應(yīng)也影響了化療的持
4、續(xù)實施,同時患者的年齡、腎功能和經(jīng)濟狀況也是影響接受化療的原因。因此,在尋求殺傷癌細胞的同時,又可以增加或者重建免疫功能,成為了臨床研究的新方向。
現(xiàn)代研究證實,惡性腫瘤的患者往往存在不同程度的免疫功能缺陷[4,5]。理論上,人體強大的免疫系統(tǒng)通過細胞免疫機制產(chǎn)生排斥反應(yīng),使突變細胞在未形成腫瘤之前即被清除,實際上許多腫瘤仍可逃避宿主的免疫攻擊而繼續(xù)生長,主要原因是由于患者全身免疫和腫瘤部免疫微環(huán)境的變化,造成腫瘤的免疫逃逸。
5、腫瘤與免疫系統(tǒng)之間存在復雜的相互作用[6],表現(xiàn)在:①免疫系統(tǒng)通過免疫應(yīng)答抑制腫瘤生長和進展;②免疫系統(tǒng)通過誘導的炎癥反應(yīng)反而促進腫瘤生長、存活和血管形成;③腫瘤利用免疫調(diào)節(jié)機制形成免疫抑制微環(huán)境,不僅抑制宿主免疫應(yīng)答,而且形成了一道阻斷抗腫瘤性免疫治療的屏障。機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)機制包括細胞免疫和體液免疫兩個方面[7],T細胞主導細胞免疫功能,是機體免疫對抗腫瘤的主力,NK細胞則具有非特異性抗腫瘤作用,二者在腫瘤細胞免疫中的地位越來越
6、受到人們的重視;B細胞介導的體液免疫在抗腫瘤免疫中起協(xié)同作用。有證據(jù)顯示腫瘤可以導致外周T細胞功能嚴重受損,降低循環(huán)T細胞的反應(yīng)性從而導致機體免疫抑制[8]。在膀胱癌動物模型中,外周血中T淋巴細胞數(shù)量減少,尤其是在腫瘤組織T淋巴細胞數(shù)目減少更加明顯,也是惡性腫瘤免疫逃逸的主要機制之一[9]。所以研究膀胱癌免疫功能抑制機制,在應(yīng)用化療藥物有效治療的同時,找到其免疫功能恢復的方法,對膀胱癌的預(yù)防和治療有重要理論及臨床意義。香菇多糖(Lent
7、inan)是從優(yōu)質(zhì)香菇子實體中提取的有效活性成分,具有抗腫瘤的作用,進入人體后誘導T細胞產(chǎn)生一種具有免疫活性的細胞因子,增強體內(nèi)自然殺傷細胞的活性,對腫瘤細胞起到防御和殺傷的作用[1]。
目前,香菇多糖主要作為一種免疫輔助藥物應(yīng)用于臨床,能配合其他抗腫瘤藥物有效促進T、B淋巴細胞增殖,并激發(fā)自然殺傷細胞活性,部分研究發(fā)現(xiàn)其本身對實體瘤也有一定的抑制作用[11],目前針對其抑制膀胱癌的作用鮮有研究,尤其是與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用抑制膀
8、胱癌的研究尚無報道。本研究分別或聯(lián)合應(yīng)用化療藥物(吉西他濱)和免疫調(diào)節(jié)劑(香菇多糖)作用于膀胱癌細胞系T24,觀察不同給藥時序所產(chǎn)生的不同作用效果,進一步明確香菇多糖在體外實驗中對T24細胞增殖和凋亡的影響作用,同時明確應(yīng)用香菇多糖對吉西他濱抑癌效果起到增效、增敏的作用。另外,通過建立MB49鼠膀胱癌細胞C57BL/6小鼠模型,檢測免疫相關(guān)細胞因子的分泌及T淋巴細胞分布時相改變從而探討膀胱癌腫瘤免疫抑制發(fā)生的具體機制;檢測膀胱癌小鼠經(jīng)化
9、療治療前后免疫功能變化情況,以及應(yīng)用香菇多糖對免疫應(yīng)答功能的改善情況。通過本課題的研究可了解香菇多糖增強吉西他濱抑制膀胱癌的作用;膀胱癌免疫抑制的分子機制,應(yīng)用吉西他濱對免疫功能的影響以及應(yīng)用香菇多糖對接受化療的荷瘤小鼠免疫功能的影響及其作用機制,為膀胱癌的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)和新的思路。
材料和方法:
體外培養(yǎng)人膀胱癌細胞系T-24,采用MTT法檢測不同濃度和作用時間的吉西他濱、香菇多糖單獨對細胞的增殖抑制效應(yīng),
10、繪制濃度-生長抑制率曲線,計算半數(shù)抑制濃度IC50; MTT法檢測吉西他濱聯(lián)合香菇多糖不同給藥時序?qū)-24細胞的增殖抑制作用;Annexin-V-FITC/PI雙標記染色法檢測各實驗組對細胞凋亡的影響及PI單染法檢測各組對細胞周期的影響;Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Survivin的表達變化。構(gòu)建Mb49鼠膀胱癌細胞C57BL/6小鼠皮下成瘤模型,分別應(yīng)用單藥或聯(lián)合用藥模式,記錄治療后各組小鼠成瘤情況,繪制生
11、長曲線、解剖小鼠、測量瘤重、取出脾臟及淋巴結(jié),并通過細胞流式染色檢測不同組別小鼠脾臟及脾周淋巴結(jié)CD3+ CD8+T細胞、CD3+ CD4+T細胞數(shù)量百分比;進一步檢測抗原提呈細胞包括CD11B+ F4/80巨噬細胞、CD11b+ Gr-1單核髓系抑制細胞(MDSCs)、樹突狀細胞兩個亞群CD11c+TRL4+ DC及CD11c+TRL9+ DC數(shù)量;以及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg) CD4+ CD25+ Foxp3+、CD152+T細胞數(shù)
12、量變化,動態(tài)觀察C57BL/6小鼠Th1免疫應(yīng)答的差異;通過ELISA檢測培養(yǎng)上清IFN-γ、 IL-2、IL-10、TGF-β等細胞因子差異,進一步驗證香菇多糖協(xié)同吉西他濱抑制膀胱癌的作用,應(yīng)用吉西他濱化療對免疫功能的影響,以及應(yīng)用香菇多糖后免疫功能的變化和其可能的作用機制。實驗數(shù)據(jù)采用-x±s表示,實驗原始數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析,組間比較采用t檢驗,組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),兩變量相關(guān)分析
13、采用Pearson相關(guān)分析,P<0.05差異具有顯著意義,P<0.01差異具有極顯著意義。
結(jié)果:
吉西他濱單獨用藥組對T-24細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性;香菇多糖單獨用藥組在其濃度<80ug/ml時對T-24細胞的增殖抑制作用亦呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,但當香菇多糖濃度達到80ug/ml時,T-24細胞對其產(chǎn)生耐藥性,增加香菇多糖的藥物濃度但抑制率無明顯改變(P>0.05)。MTT結(jié)果提示兩藥聯(lián)合時對
14、T-24細胞的抑制作用明顯強于單一用藥,結(jié)果差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);且最佳給藥時序為兩者同時給藥。Annexin-V-FITC/PI雙標記染色法結(jié)果也提示兩藥同時處理T-24細胞時的凋亡率高于其他處理組(P<0.01)。PI單染法結(jié)果示吉西他濱和香菇多糖單獨用藥組或兩者聯(lián)合用藥組都能使S期細胞比例減少,G1期比例增加(p<0.05),其中吉西他濱單藥或香菇多糖單獨用藥作用下停滯于G1期的細胞更多些,處于S期細胞更少些(
15、p<0.05),但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。Mb49鼠膀胱癌細胞移植可成功建立C57BL/6小鼠植瘤模型。給予香菇多糖輔助治療后小鼠生存期較單用吉西他濱延長,腫瘤體積和腫瘤重量減小,給予香菇多糖可以大大提高抗腫瘤免疫應(yīng)答增加CD3+ CD4+T細胞和CD3+ CD8+T細胞數(shù)量,促進IFNγ和IL-2分泌,增加CD11c+ TRL4+ DCs的百分比,還可促進CD11b+F4/80+巨噬細胞活化;香菇多糖的使用還可明顯降
16、低MDSCs數(shù)量,也可降低CD4+ CD25+ Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量,抑制IL-10分泌,組間差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結(jié)論:
體外實驗證實,香菇多糖單獨用藥可以抑制膀胱癌細胞系T24增殖及誘導凋亡,吉西他濱與香菇多糖聯(lián)合作用于人膀胱癌T-24細胞時,香菇多糖對吉西他濱起到增效、增敏的作用,對T-24的抑制增殖和誘導凋亡的作用明顯大于單一用藥,且最佳時機可能是兩種藥物同時作用于T-24細胞。
17、
應(yīng)用香菇多糖后荷瘤小鼠生存期較單用吉西他濱延長,腫瘤體積和腫瘤重量減小,且可以大大提高抗腫瘤免疫應(yīng)答,增加CD3+ CD4+T細胞和CD3+ CD8+T細胞數(shù)量,促進IFNγ和IL-2分泌,間接達到抗腫瘤的作用;而這這一作用可能是通過DCs活化,尤其是CD11c+ TRL4+ DCs的活化誘導有效的Th1細胞免疫應(yīng)答而達到的,TLR4是介導MB49荷瘤小鼠DCs活化的重要模式識別受體;另外香菇多糖還可促進CD11b+F4/8
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