通絡(luò)方藥調(diào)脂、抑炎及抗凝作用的分子機制研究.pdf

1、論文Ⅰ通心絡(luò)調(diào)脂、抑炎及抗凝作用的機制研究 背景： 本研究以辛伐他汀作為陽性對照藥物，應(yīng)用本實驗室已成功構(gòu)建的動脈粥樣硬化動物模型方法，運用分子生物學及組織學等技術(shù)，觀察通心絡(luò)超微粉通過調(diào)脂、抑制炎癥反應(yīng)和抗凝作用防治動脈粥樣硬化的療效，并闡明其分子生物學機制及相互作用的聯(lián)系靶點。 目的： （1）建立與人類動脈粥樣硬化病變特征相似，易于觀察藥物療效的動脈粥樣硬化動物模型； （2）應(yīng)用血清學、組織學

2、及分子生物學技術(shù)觀察動脈粥樣硬化病變過程中脂質(zhì)、炎癥及凝血機制的變化，并找出共同作用的靶點； （3）對比不同劑量通心絡(luò)超微粉和辛伐他汀治療防治動脈粥樣硬化的療效及其分子生物學機制。 方法： 1.動物模型的建立 健康雄性新西蘭大白兔，在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用球囊損傷腹主動脈后，應(yīng)用含有1％高膽固醇飼料喂養(yǎng)10周。 2.實驗分組及藥物干預 造模成功后隨機分為對照組、小劑量、中劑量、大劑量通心絡(luò)

3、組和辛伐他汀組： 3.稱量體重 實驗前、10周造模后及18周末藥物干預后分別對所有實驗兔稱量體重。 4.高頻體表超聲檢查 分別于實驗開始、10周末、18周末行腹主動脈高頻體表超聲檢查。測量腹主動脈后壁內(nèi)膜-中層厚度、腹主動脈收縮期血流峰值速度。 5.肝腎部分功能檢查 分別于實驗開始、10周末及18周末，采血作血液生化檢查，主要包括ALT， GGT，TBIL，BUN和Cr。 6.血脂

4、檢測 分別于實驗開始、10周末及18周末采血作血液生化檢查。采用酶法測定血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇水平。 7.血清炎性因子的檢測 分別于實驗開始、10周末及18周末采血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測氧化低密度脂蛋白、血清高敏C反應(yīng)蛋白、血清sICAM-1及sVCAM-1的濃度。 8.血漿纖溶指標的檢測 分別于實驗開始、10周末及18周末采血，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血

5、漿PAI-1、t-PA的濃度水平。 9.病理染色 留取球囊拉傷處腹主動脈標本，行蘇木素-伊紅染色、油紅O染色和Movat五色套染法染色。 10.免疫組織化學染色 對腹主動脈球囊損傷處血管段進行組織切片，行膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白、RAM11、VCAM-1、ICAM-1、及CRP免疫組織化學染色，此外并對肝臟組織切片行CETP及LRP的免疫組織化學染色。 11.Western bl

6、ot 留取肝臟及血管標本，檢測組織中CETP及LRP蛋白表達水平。 12.掃描電鏡 各組均留取標本進行掃描電子顯微鏡檢查，觀察血管內(nèi)膜損傷及脂質(zhì)沉積的情況。 13.統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，連續(xù)性數(shù)據(jù)用x±SD表示，P<0.05有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果： 1.實驗動物基本情況 進入藥物干預階段的實驗兔中，辛伐他汀組死亡1只，大劑量通心絡(luò)組死亡2只，中、小劑

7、量通心絡(luò)組各死亡1只，死亡原因分別為腹瀉、呼吸道感染或原因不明。 2.實驗動物體重的變化 10周術(shù)所有實驗兔體重均較實驗開始前加重，相比均有顯著性差異，但治療后各組實驗兔之間無顯著差異。 3.高頻體表超聲 10周末，所有實驗兔IMT均顯著升高，Vp值顯著升高；治療后C、D、E三組IMT較對照組相比顯著降低，D、E兩組Vp值顯著降低。 4.肝腎功能檢測 18周末，辛伐他汀組血清ALT、GGT

8、兩者濃度顯著高于其他組，其他各組之間無顯著差異。 5.血脂檢測 組內(nèi)比較：10周末，除HDL-C外，所有實驗兔較造模前各項指標相比均顯著升高；18周末，各組血脂含量除HDL-C外，與治療前相比均顯著降低。 治療后組間比較：與A組比較，各藥物治療組均可明顯降低血清TC水平，大劑量通心絡(luò)組和辛伐他汀組組間無顯著性差異；大劑量通心絡(luò)組TC水平明顯低于小劑量通心絡(luò)組； 6.血清炎性因子的檢測 組內(nèi)比較：1

9、0周末造模成功實驗兔血清ox-LDL、hs-CRP、sICAM-1及sVCAM-1水平較實驗初始相比均顯著升高；18周末，C、D、E各組炎性因子血清水平均顯著下降。 組間比較：與A組比較，治療后中、大劑量通心絡(luò)組和辛伐他汀組均可明顯降低血清炎性因子hs-CRP的水平，由低到高依次為E組、D組和C組。D組與E組降低hs-CRP水平無顯著性差異； 7.血漿纖溶指標的檢測 組內(nèi)比較：治療后除對照組外，其他各組血漿PAI

10、-1水平顯著降低，t-PA水平均顯著升高。 組間比較：18周末，與對照組相比，B、C、D三組血漿PAI-1水平顯著降低，C、D兩組最顯著；與對照組比較，C、D、E三組血漿t-PA水平顯著升高，但以D組差異最顯著。 8.病理染色 HE染色顯示，造模成功后各組血管斑塊明顯，治療后各組間未見明顯差異；油紅“O”染色顯示，對照組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著高于藥物組；Movat結(jié)果顯示，對照組動物斑塊內(nèi)部基質(zhì)和粘蛋白含量顯著高于

11、藥物組，各藥物組間未見差異。 9.免疫組織化學染色 五組斑塊內(nèi)均有CETP、LRP、RAM11、VCAM-1、ICAM-1、及CRP的局部表達；與對照組相比，藥物組LRP、RAM11、VCAM-1、ICAM-1及CRP表達均顯著減少，其中D、E兩組較其他3組相比表達更低，而C組和B組間未見差異；E組CETP蛋白表達顯著低于其他四組，四組間比較無顯著差異。肝臟CETP及LRP免疫組織化學染色結(jié)果與其血管斑塊內(nèi)表達結(jié)果相似。

12、 10.Western blot 各組肝臟及斑塊中均有CETP、LRP的高度表達，其中D、E兩組LRP蛋白表達顯著低于其他三組，兩組間無顯著差異；E組CETP蛋白表達水平顯著低于其他四組，其余四組間比較無顯著差異。 11.掃描電鏡 各組內(nèi)皮細胞均有不同程度損傷，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞排列紊亂，內(nèi)膜較多區(qū)域有細胞脫落，暴露內(nèi)皮下膠原，脫落區(qū)附近有大量紅細胞、血小板及脂滴黏附，低倍鏡下可見病變區(qū)域廣泛，內(nèi)皮隆起區(qū)

13、域部分融合，形成表面粗糙的“斑塊”狀病變。A組內(nèi)膜損傷顯著甚于其他藥物組，藥物組間比較發(fā)現(xiàn)，D、E兩組損傷顯著較輕，C組和B組間未見顯著差異。 結(jié)論： （1）應(yīng)用球囊損傷加高脂飼養(yǎng)方法可建立與人類動脈粥樣硬化病變特征相似、造模時間短及適于觀察藥物療效的動物模型，結(jié)合血脂水平的檢測，應(yīng)用高頻體表超聲可判定模型的建立情況。 （2）通心絡(luò)超微粉能夠不通過抑制CETP升高HDL-C，保護了體內(nèi)的正常膽固醇逆轉(zhuǎn)運功能。

14、 （3）大劑量通心絡(luò)超微粉能有效降低血脂，抑制炎癥反應(yīng)及增強纖溶功能其作用的共同靶點可能是LRP。 論文Ⅱ薤白對氧化低密度脂蛋白誘導的內(nèi)皮細胞組織因子及其抑制物表達的干預作用 背景： 本實驗采用原代人主動脈內(nèi)皮細胞，以ox-LDL作為內(nèi)皮細胞氧化損傷的誘導因子，觀察了不同濃度及不同時間點ox-LDL對于體外培養(yǎng)HAECs Lox-1、TF及TFPI蛋白表達的影響，并觀察薤白對ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞氧化損傷

15、的防治作用。 目的： （1）建立人主動脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的模型； （2）觀察不同劑量濃度薤白超微粉抑制氧化低密度脂蛋白誘導的內(nèi)皮細胞表達促凝因子的作用及其機制。 方法： 為建立內(nèi)皮細胞氧化損傷模型，確定ox-LDL最終刺激濃度及刺激時間，本實驗通過體外培養(yǎng)人主動脈內(nèi)皮細胞，觀察不同濃度和不同時間ox-LDL刺激后，入主動脈內(nèi)皮細胞Lox-1、TF及TFPI蛋白的表達變化，選定ox-LDL的最佳刺激

16、條件。 不同濃度的薤白超微粉預孵育12h后再加ox-LDL刺激，同時應(yīng)用Lox-1阻斷劑-Poly做對照組，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，并且用western-blot方法檢測各組Lox-1、TF及TFPI的蛋白表達水平。 結(jié)論： （1）50ug/ml ox-LDL培養(yǎng)人主動脈內(nèi)皮細胞24h顯著升高Lox-1蛋白表達水平，同時引起TF蛋白表達增強和TFPI蛋白的表達受到抑制，選為本實驗的最佳刺激條件；